Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 172
Текст из файла (страница 172)
Создание искусственной хромосомы дрожжей (УАС). Вектор УАС позволяет клон ировэть очень большие молекулы ДИК. ТГ Ь С 6Н и О К! — это последовательности теломеры, центромеры и точки начала реял и нации соотеетсгвенно дрожжей 5ассбагоглусез сегеииае; все эти участки необходимы для размножения УАС. Ввго Н1 и Есов! — это свйты, по которым соответсшующие рестриктэзы расщепляют двойную спираль ДНК. Последовательности, обозначенные А и В, кодируют ферменты, служащие селенги в ными маркерами для упрощения идентификации дрожжевых клеток, содержащих искусственную хромосому. Поскольку бактерии делятся быстрее, чем дрожжи, в настоящее время в большинстве широкомвсштвбных проектов по клонированию для эмплификэции ДИК используют Е сей (Адаптировано из О.
Т. Вот)ш, Б. Е Свг(е аль М. Н. О(зоп, 5с(енсе 236: 806-812, 1987. С любезного разрешения издательства ААА5.) клон называется клоном кДНК, а весь наГюр клонов, полученных из единократного выделения мРНК, составляет библиотеку кДНК. На рнс. 8А4 показаны некоторые важные различия между клоналги геномной ДНК и клонами кДНК. Геномтгые клоны представггяют собой случайный набор всех последовательностей ДНК организма, и, за редким исключением, они одинаковы В.ф. Анализ и манипуяящеид ДнК 837 ы/ / - Д~ ЛИЗИРОВАНИЕ КЛЕТОК (например, мозга) И ОЧИСТКА мРНК мРНК 3' ллллллл ! ГИБРИДИЗАЦИЯ С ПОЛИ(Т)-ПРАЙМЕРОМ 3' ОБРАЗОВАНИЕ КОМПЛЕМЕНТАРНОЙ т т т т т т т ДНК-КОПИИ ПРИ ПОМОЩИ 3' 5' ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПТАЗЫ мРНК 5' 3' ттттттт ~ РАСЩЕПЛЕНИЕ РНК ~ ПРИ ПОМОЩИ РНКаэы Н 5' 3' ттттттт ! ФРАГМЕНТ РНК СЛУЖИТ ПРАЙМЕРОМ ДЛЯ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ, СИНТЕЗИРУЮЩЕЙ ВТОРУЮ ЦЕПЬ кДНК 3' ллялллл ! ттттттт 5' 3' Рис.
8.43. Синтез кДНК. Из ткани выделяют всю мРНК, и фермент обратная транскриптаза синтезирует комплементарные к молекулам РНК молекулы ДНК (кДНК) (см. стр. 320). Для простоты показано копирование в ДНК только одной такой мРНК. Сначала короткий олигонуклеотид, служащий праймером для обратной транскриптазы, гибридизуется с комплементарным поли(А)-хвостом на Зсконце мрНК (см.
главу 6). Затем обратная гран сир и отава копирует РНК в ком ил еме итар ную цепь ДН К, образуя гибридную двойную спираль ДНК/РНК. Обработка гибрида ДНК/РНК ферментом рибонуклеазой Н (см. рис. 532) приводит к образованию разрывов и пропусков в цепи РНК. Затем фермент ДНК-полимераэа копирует оставшуюся одноцепочечную кДНК с образованием двойной спирали кДНК. Праймером этой реакции синтеза служит учапок исходной мРНК. Поскольку ДНК-полимераза, используемая для синтеза второй цепочки ДНК, может работать через связанные молекулы РНК, участок РНК, основания которого с 3с конца спарены с первой цепочкой ДНК, обычно служит праймером для конечного продукта синтеза второй цепи.
Эта РН К впоследствии деградирует при клонировании. В результате ну илеотидные последовательности с 5'-концов исходных молекул мРНК часто отсутствуют в библиотеках кДНК. 8.4. Анализ и манипуляции с ДНК 8З9 теке (см. Рис. 8А4). Гемоглобин, например, в больших количествах синтезируется в развивак>шихся эритроцитах (красных кро»иных тельцах); именно поэтому гены глобинов клонировали одними из первых. Наиболее важным преимуществом клонов кДНК является тот факт, что они содержат непрерывную кодирующую последовательность гена.
Как мы видели, гены эукариот обычно состоят из коротких кодируюших последовательностей ДНК (экзонов), отделенных друг от друга значительно более длинными некодируквцими последовательностями (интронами); синтез мРНК включает в себя удаление некодирующих последовательностей из исходного транскрипта РНК и склеивание (сплайсинг) кодирукпцих последовательностей. Ни в бактериальной, ни в дрожжевой клетках РНК, полученная из гена высшей эукариотической клетки, не будет претерпевать таких модификаций.
Таким образом, когда целью клонирования является расшифровка аминокислотной последовательности белка из последовательности ДНК или получение белка в больших количествах путем экспрессии клонированного гена в бактериальной или дрожжевой клетке, предпочтительнее начинать с кДНК. Библиотеки кДНК обладак>т дополнительными применениями: как описано в главе 7, многим мРНК человека и других сложных организмов свойственен альтернативный сплайсинг, и библиотека кДНК зачастую содержит большинство, если не все, альтернативные варианты мРНК, содержащиеся в данной клеточной линии или ткани. Геномные библиотеки и библиотеки кДНК вЂ” это неисчерпаемые ресурсы, которыми исследователи делятся между соГюй.
Сегодня многие такого рода библиотеки доступны из коммерческих источников. 8.4.9. Гены можно селективно амппифицировать с помощью полимеразной цепной реакции Сейчас, когда доступно огромное количество геномных последовательностей, гены могут быть клоннрованы напрямую без предварительного создания библиотеки ДНК. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) сделал возможным быстрое клонирование. Взяв целый геном, ПЦР позволяет амплифицировать ДНК выбранного участка в миллиарды раз, эффективно «очищая» данную ДНК от остального генома.
Сначала химическими методами синтезируют пару олигонуклеотидов ДНК, прилегак>щих с двух сторон к нужной нуклеотидной последовательности гена. Эти олигонуклеотиды затем используют в качестве праймеров синтеза ДНК на одиночных цепях, полученных путем нагревания ДНК всего генома. Заново синтезированную ДНК получают в реакции, катализируемой (л г>1(го очищенной ДНК-полимеразой, и праймеры остан>тся на 5'-концах конечных фрагментов ДНК (рнс. 8А5, и). Во время первого цикла синтеза ДНК ничего особенного не получается; сила метода ПЦР раскрывается только через несколько повторений цикла синтеза ДНК. Каждый цикл удваивает количество синтезированной в прошлом цикле ДНК. Поскольку каждый цикл требует краткого нагревания для разделения цепей двойной спирали ДНК, необходимо использование специальной ДНК-полимеразы, которая не будет денатурировать при нагревании.
Такую ДНК-полимеразу выделяют из термофильных бактерий, и она устойчива к значительно более высоким температурам, чем обычные белки. С каждым новым циклом синтеза ДНК новые фрагменты служат шаблонами для следующих, и через несколько циклов преимущественным продуктом реакции будет один вид ДНК, чья длина соответствует расстоянии> между двумя исходными праймерами (см. Рис. 8.45, б). 3.4> Анализ и манипуляции сДНК 841 На практике аффективная амплификация ДНК требует 20 — 30 реакционных циклов, продукты каждого цикла служат шаблонами ДНК для следующего — от. сюда термин полимеразная «цепная реакция». На прохождение одного цикла за трачивается всего около 5 минут, и весь процесс можно легко автоматизировать. Таким оГ>разом, ПЦР делает возможным бесклеточное молекулярное клонирование» фрагмента ДНК за несколько часов, п>гда как для стандартного клонирования требуется несколько дней.
Этот метод в настоящее время повсеместно используют для прямого клонирования ДНК интересующих генов, когда исходным материалом служит лн(ю геномная ДНК. либо выделенная из клеток мРНК (рис. ()Аб). клетки ~~)~~ СГ '-:- выделение ДНК выделение мРНК кпонируемвя последовательность ДОБАВЛЕНИЕ ПЕРВОГО ПРАЙМЕРА, ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПТАЗЫ И ДЕЗОКРИБОНУКЛЕОЗИДТРИФОСФАТОВ кДНК РНК РАзделение цепей И ДОБАВЛЕНИЕ ВТОРОГО ПРАЙМЕРА АМПЛИФИКАЦИЯ ПЦР кДНК клоны б) ~м.ж и РАзделение цепей АМПЛИФИКАЦИЯ ПЦР геномныв а) Рис. 8.46.
Получение геномного клона или клона кДНК с помощью полимеразной цепной реакции. а) Чтобы получить геномный клон, сначала из клеток выделяют хромосомную ДНК. Затем добавляют праймеры для ПЦР, фланкирующие клонируемый участок ДНК, и проводят много циклов реакции (см. рис. 8 45). Поскольку амплнфицируется только ДНК, заключенная между (и содержащая) праймеры, ПЦР позволяет селективно получить короткие участки хромосомной ДНК в чистом виде. б) Для того чтобы использовать ПЦР для получения клона кДНК гена, сначала из клеток выделяют мРНК. Затем к смеси мРНК добавляют первый праймер, и обратная транскриптаза синтезирует комплементарную цепь ДНК.
После этого добавляют второй праймер, и одноцепочечная молекула кДНК амплифицируется в последовательных циклах ПЦР, как показано на рис. 8.45. 8 обоих типах клонирования необходимо заранее знать нуклеотидную последовательность по крайней мере части кланируемого фрагмента. 842 ЧаСТВ,!((. МВТОДЬЗ а) РА3ДЕЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ ПЦР В ГЕЛЕ првймеры Лпя вмплнфкквакк ПЦР гсмгщсгкчные хромосомы кз' повторяющиеся послеааеательнастк лакусз УМТЛ б) ждаэреваемый А )ЭВ(В ЫВ(йй( Вээ( й(((эр аз э покус 1 'И (Вййууэй покус 2 покус 3 подозреваемый В фээй, т з жщозрввавмый С Ф мб В(((йг' йййййб(У Взйэфб ) э я~- Вфла'„уз( ".':,.* ) й е Вэээй-: ' -".«!'-;" у;В(вч) 30 й 25 Е 2о с 15 к 1О о Рнс. В.47.
Использование палимеразной цепной реакции в судебно-медицинсной экспертизе. а) Последовательность ДНК, создающая использующуюся в анализе вариабельность, сосюнт из коротких повторяющихся последовательностей, например, САСАСА..., которые располагаются в различных участках (покусах) человеческого генома. Количество повторений в каждом случае может быль высоковариабельным в популяции, в пределах от 4 до 40 у разных людей.
Последовательность повторов такого типа часто называют гипереориабельными микросателлитыми лоследоеательностямц — также известными, как покусы с варьирующимся числом тандемных повторов (ЧапаЫе Нитоег о( Тапдепт йереа1, Угутй). Пасхальну в каждом покусе последовательности различаются, люди обычно наследуют различные варианты от матери и ат отца; таким образом, не находящиеся в родстве люди обычно не обладают одинаковыми парами последовательностей.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
