Том 1 (1129743), страница 98
Текст из файла (страница 98)
В самой вилке — одна на опережающейнити, другая на отстающей нити — работают две молекулы ДНК-полимеразы. Тогдакак молекула ДНК-полимеразы на опережающей нити может работать непрерывно,молекула ДНК-полимеразы на отстающей нити должна начинать свою работу вновьи вновь через короткие промежутки времени, используя короткую РНК-затравку,тут же изготавливаемую молекулой ДНК-праймазы.
Тесное сотрудничество всехэтих белковых компонентов увеличивает эффективность репликации и становитсявозможным благодаря определенной укладке отстающей нити «петлей назад», какпоказано на рис. 5.19, а. Кроме того, такая организация облегчает установку зажимаполимеразы при каждом цикле синтеза фрагмента Оказаки: установщик зажима имолекула ДНК-полимеразы на отстающей нити остаются на своих местах как частьбелковой машины, даже когда они отделяются от своей матрицы ДНК. Репликационные белки, таким образом, связаны друг с другом в единый большой комплекс(полная молекулярная масса > 106 дальтон), что позволяет ДНК синтезироватьсяпо обе стороны репликационной вилки согласованно и эффективно.На отстающей нити реплицирующая ДНК машина оставляет позади себя рядфрагментов Оказаки с незаделанными зазорами между ними, которые на своих5'-концах все еще содержат РНК, которая затравливала их синтез.
Эта РНК удаляется, и образующийся зазор заделывается ферментами репарации ДНК, которыеработают позади репликационной вилки (см. рис. 5.12).5.2.9. Ошибки репликации, которые допускает репликационная машина, удаляет направляемая цепью система исправления ошибокспариванияКак было сказано ранее, бактерии наподобие E. coli способны делиться одинраз каждые 40 минут, благодаря чему имеется возможность сравнительно легкопроводить массовый анализ больших популяций, чтобы найти редкую мутантнуюклетку, видоизменившуюся в определенном процессе. Представители одного интересного класса мутантов содержат изменения в так называемых генах-мутаторах,которые значительно увеличивают частоту самопроизвольных мутаций.
Не удивительно, что один такой мутант производит дефектную форму 3' → 5' корректирующей экзонуклеазы, которая является частью фермента ДНК-полимеразы (см.рис. 5.8 и 5.9). Мутантная ДНК-полимераза не может эффективно корректироватьДНК, и многие ошибки репликации, которые в ином случае были бы удалены,накапливаются в ДНК.Изучение других мутантов E. coli, проявляющих аномально высокую частоту мутаций, выявило систему коррекции неправильного спаривания (mismatchproofreading system), которая удаляет ошибки репликации, допущенные полимеразой и пропущенные корректирующей экзонуклеазой.
Такая направляемая цепью458Часть 2. Основные генетические механизмыРис. 5.19. Активная репликационная вилка. а) На этом схематическом рисунке показано взаимное расположение белков в репликационной вилке в процессе синтеза ДНК. ДНК отстающей нити свернулась,чтобы свести молекулу ДНК-полимеразы на отстающей нити в один комплекс с молекулой ДНК-полимеразына опережающей нити. Кроме того, в результате такой укладки 3'-конец каждого законченного фрагмента Оказаки оказывается вблизи участка начала следующего фрагмента Оказаки. Поскольку молекулаДНК-полимеразы на отстающей нити остается связанной с остальными репликационными белками, онаможет многократно использоваться для синтеза последовательных фрагментов Оказаки.
На этой схемеона собирается выпустить завершенный ею фрагмент ДНК и перейти к РНК-затравке, которая будет синтезирована поблизости, что необходимо для начала следующего фрагмента ДНК. Дополнительные белки(не показаны) помогают удерживать различные белковые компоненты вилки вместе, что позволяет имработать как хорошо согласованная белковая машина. б) Электронный микрофотоснимок, показывающийрепликационную машину бактериофага T4 в момент ее продвижения по матрице, когда она оставляетпозади себя новосинтезированную ДНК.
в) Интерпретация этой микрофотографии дана в эскизе: обратите особое внимание на петлю ДНК на отстающей нити. Очевидно, репликационные белки частичноотделились от ДНК непосредственно перед репликационной вилкой во время подготовки этого препаратадля электронной микроскопии. (Фотоснимок б любезно предоставлен Jack Griffith; см.
P. D. Chastain et al.,J. Biol. Chem. 278: 21276–21285, 2003.)Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 459система исправления ошибок спаривания (strand-directed mismatch repair) выявляет потенциальные места искажений в спирали ДНК, что обусловлено плохой«подгонкой» оснований, некомплементарных друг другу.Если бы такая корректирующая система попросту узнавала ошибки спаривания в недавно реплицированной ДНК и случайным образом исправляла один издвух несоответствующих друг другу нуклеотидов, то точно в половине случаев онаошибочно «исправляла» бы исходную матричную нить, приводя ее в соответствиеошибке, и, таким образом, средняя частота появления ошибок никак не снизиласьбы.
Чтобы быть эффективной, такая корректирующая система должна различатьи удалять несоответствующий нуклеотид только на вновь синтезированной нити,в которой и произошла ошибка репликации.У E. coli механизм различения нитей, используемый системой исправленияошибок спаривания, связан с метилированием определенных остатков А в ДНК.Метильные группы присоединяются ко всем остаткам А в последовательностиGATC, но лишь по прошествии некоторого времени после включения А в новосинтезированную цепь ДНК. В результате последовательности GATC, которые еще небыли метилированы, встречаются единственно лишь в новосинтезированных нитяхсразу после репликационной вилки. Распознавание таких неметилированных последовательностей GATC позволяет в течение короткого периода отличать новыенити ДНК от старых, что и требуется для избирательного удаления ошибок, допущенных именно при репликации.
Состоящий из трех этапов процесс включает всебя распознавание ошибки спаривания, вырезание сегмента ДНК, содержащего этуошибку, из новосинтезированной нити и повторный синтез вырезанного сегментас использованием старой нити в качестве шаблона. Такая направляемая нитью система корректировки еще в 100 раз уменьшает число ошибок, допущенных в ходерепликации ДНК (см. таблицу 5.1, стр.
271).Подобная система коррекции ошибок спаривания несет свою службу и в клеткахчеловека (рис. 5.20). Вся значимость этой системы для людей становится очевиднойпри взгляде на индивидумов, которые унаследовали одну дефектную копию генаисправления ошибок спаривания (наряду с функционально активным геном надругой копии хромосомы). Такие люди имеют выраженную предрасположенностьк некоторым типам рака.
Например, при разновидности рака ободочной кишки,называемого наследственный неполипозный рак прямой и ободочной кишки(HNPCC), самопроизвольная мутация второго, функционально активного генапроизводит клон соматических клеток, которые, поскольку в них не выполняетсякоррекция неправильного спаривания, накапливают мутации необычайно быстро.Большинство видов рака возникает в клетках, которые накопили множественныемутации (см. рис. 20.11), и поэтому клетки, лишенные возможности исправлятьошибки репликации, имеют все основания стать злокачественными.
К счастью,большинство из нас наследует обе доброкачественные копии гена, который кодируетбелок коррекции неправильного спаривания; и это защищает нас, так как оченьмала вероятность того, что в одной клетке мутируют сразу обе копии.В клетках эукариот механизм распознавания новосинтезированной цепи отродительской матричной в месте неправильного спаривания не зависит от метилирования ДНК.
И в самом деле, у некоторых эукариот — а в их числе дрожжи идрозофила, — не происходит метилирования своей ДНК. Недавно синтезированнаяДНК отстающей нити непродолжительное время имеет надрезы (прежде чем онибудут зашиты ДНК-лигазой), и биохимические эксперименты показывают, что такие460Часть 2. Основные генетические механизмынадрезы (называемые также одноцепочечными разрывами) являются сигналом,который нацеливает систему коррекции неправильного спаривания на должнуюнить (см.
рис. 5.20). Логично предположить, что для работы такой системы также необходимо, чтобы вновь синтезированная ДНК на опережающей нити имелакратковременные надрезы — как это происходит, пока еще не ясно.5.2.10. Спутывание ДНК во время репликации предотвращают ДНКтопоизомеразыПри продвижении репликационной вилки по двунитевой ДНК возникает проблема, которая получила название «проблемы закручивания» (winding problem)ДНК.
Дело в том, что каждые 10 пар нуклеотидов, реплицированных в вилке, соответствуют одному полному обороту вокруг оси родительской двойной спирали;поэтому, для того чтобы репликационная вилка могла двигаться, вся хромосомаперед вилкой должна была бы вращаться с большой скоростью (рис. 5.21). В случаеРис. 5.20.
Модель направляемого цепью исправления ошибок спаривания у эукариот. а) Два изображенных белка присутствуют как у бактерий, так и в клетках эукариот: MutS специфично связывается скомплементарными основаниями, тогда как MutL просматривает близлежащую ДНК на предмет наличияразрыва. Как только MutL находит разрыв, он запускает деградацию разорванной нити на всем протяжении несоответствия оснований принципу комплементарности. Поскольку у эукариот разрывы главнымобразом возникают в пределах новореплицированных нитей ДНК, постольку ошибки репликации избирательно и удаляются. У бактерий механизм тот же самый, за исключением того, что дополнительныйбелок в комплексе (MutH) делает надрезы на неметилированных (а значит, недавно реплицированных)последовательностях GATC, таким образом начиная процесс, проиллюстрированный на данной схеме.
б)Структура белка MutS, задача которого — убрать ошибки на ДНК. Этот белок представляет собой димер,который, как показано, захватывает двойную спираль ДНК, образуя петлю ДНК в области некомплементарных оснований. Кажется, что белок MutS «просматривает» ДНК, ища ошибки путем проверкиналичия участков, которые могут быть легко согнуты в петлю, потому что составляющие ее основанияне образуют нормальной комплементарной пары.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
