Том 1 (1129743), страница 99
Текст из файла (страница 99)
(Изображение б заимствовано из G. Obmolova et al.,Nature 407: 703–710, 2000. С любезного разрешения издательства Macmillan Publishers Ltd.)Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 461Рис. 5.21. Проблема закручивания ДНК, которая возникает в ходе репликации. У бактерийдля продвижения репликационной вилки соскоростью 500 нуклеотидов в секунду родительская спираль ДНК перед этой вилкой должнавращаться с частотой 50 оборотов в секунду.длинных хромосом это потребовалобы большого количества энергии, ипоэтому тут используется альтернативная стратегия: в спирали ДНК образуется шарнир, который формируютбелки, известные под названием ДНКтопоизомераз.ДНК топоизомераза может рассматриваться как обратимая нуклеаза,которая сама ковалентно соединяется сфосфатом основной цепи ДНК и такимобразом разрывает фосфодиэфирнуюсвязь в нити ДНК.
Эта реакция обратима, и фосфодиэфирная связь вновьобразуется, как только белок покидает«насиженное место».Топоизомераза одного типа, названная топоизомеразой I, производит временный однонитевой разрез (или надрез); этот разрыв фосфодиэфирной связи в сахарофосфатном остове позволяетдвум отрезкам спирали ДНК по обе стороны надреза свободно вращаться друготносительно друга, используя фосфодиэфирную связь в противоположной надрезунити в качестве точки вращения (рис. 5.22). Любое напряжение в спирали ДНКбудет осуществлять такое вращение в направлении, снижающем это напряжение.В результате репликация ДНК может идти своим чередом при вращении толькокороткого отрезка спирали — части, лежащей сразу перед вилкой.
Посколькуковалентная связь, которая соединяет белок ДНК-топоизомеразу с фосфатом вцепи ДНК, сохраняет в себе энергию расщепленной фосфодиэфирной связи, еелигирование происходит быстро и не требует дополнительной энергетической подпитки. В данном отношении этот механизм воссоединения фосфодиэфирной связиотличается от такового, катализируемого ферментом ДНК-лигазой, о котором мыговорили раньше (см. рис. 5.13).ДНК-топоизомераза второго типа, топоизомераза II, образует ковалентнуюсвязь одновременно с обеими цепями спирали ДНК, производя временный двухцепочечный разрыв в спирали. Эти ферменты активируются на хромосомах вучастках, где две двойные спирали пересекают друг друга.
Как только молекулатопоизомеразы II связывается с таким участком пересечения, она тут же используетгидролиз ATP, чтобы эффективно выполнить следующий набор реакций: 1) обратимо разорвать одну двойную спираль, чтобы создать в ней «ворота»; 2) заставитьвторую, близлежащую, двойную спираль пройти через эти «ворота» и 3) после этогозапечатать разрыв («закрыть ворота») и отделиться от ДНК (рис. 5.23). Таким вот462Часть 2. Основные генетические механизмыРис. 5.22.
Обратимая реакция надрезания ДНК, катализируемая ферментом ДНК-топоизомеразой Iэукариот. Как показано, эти ферменты на короткий момент образуют одну-единственную ковалентнуюсвязь с ДНК; благодаря этому становится возможным свободное вращение ДНК вокруг ковалентныхсвязей сахарофосфатного остова, сцепленного с синим фосфатом.Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 463Рис. 5.23. Модель механизма действия топоизомеразы II.
Как показано на схеме, связывание ATP сдвумя ATPазными доменами вызывает их димеризацию и обеспечивает протекание представленныхреакций. Поскольку один цикл этой реакции может произойти в присутствии негидролизуемого аналогаATP, постольку гидролиз ATP, как думают, необходим только для перезарядки фермента в каждом новомцикле реакции. Эта модель основана на данных структурного анализа фермента в сочетании с результатами биохимических экспериментов. (Переработано из J. M. Berger, Curr. Opin.
Struct. Biol. 8: 26–32, 1998.С любезного разрешения издательства Elsevier.)образом ДНК-топоизомеразы типа II могут эффективно разделять два сцепленныхкольца ДНК (рис. 5.24).Та же реакция предотвращает также серьезные проблемы спутывания ДНК,которые в противном случае возникали бы в ходе репликации ДНК. Эту функциюпрекрасно иллюстрируют мутантные клетки дрожжей, которые производят вместонормальной топоизомеразы II вариант, который инактивируется при температуревыше 37 °C. Когда мутантные клетки нагревают до этой температуры, их дочерниехромосомы остаются переплетенными после репликации ДНК и не могут отделиться одна от другой.
Огромную пользу топоизомеразы II как инструмента дляраспутывания хромосом сможет в полной мере оценить лишь тот, кому хоть разприходилось биться над неожиданно объявившейся на рыболовной леске «бородой»,не имея ножниц под рукой.5.2.11. Репликация ДНК у эукариот и бактерий в основе своей схожаЛьвиная доля наших познаний о репликации ДНК изначально получена в ходеисследований, проведенных на выделенных из бактерий и бактериофагов очищенныхмультиферментных системах, способных реплицировать ДНК in vitro.
Развитиетаких систем в 1970-е гг. во многом обязано предшествующим исследованиям повыделению мутантов из огромного разнообразия отвечающих за репликацию генов;такие мутанты использовались для идентификации и очистки соответствующихрепликационных белков. Первая система репликации у млекопитающих, котораяв точности реплицировала ДНК in vitro, была описана в середине 1980-х гг.,а мутации в генах, кодирующих почти все компоненты репликационной системы,к настоящему времени выделены и проанализированы у дрожжей Saccharomycescerevisiae. В результате многое стало известно о тонких особенностях репликацииДНК у эукариот, и теперь ясно, что фундаментальные особенности репликации ДНК— геометрия репликационной вилки и использование мультиферментной белковой464Часть 2.
Основные генетические механизмыРис. 5.24. Процесс разделения двух кольцевых молекул ДНК, катализируемый ДНК-топоизомеразойII. Для распутывания своей ДНК клетки прибегаютк любым ухищрениям. В отличие от топоизомеразтипа I, ферменты типа II используют гидролиз ATP, анекоторые бактериальные варианты могут создаватьдополнительное напряжение в ДНК. Сфера действиятопоизомераз типа II в основном ограничена растущими клетками эукариот; отчасти по этой причинеони стали популярными мишенями при разработкепротивораковых препаратов.репликационной машины — оставалиськонсервативными на всем протяжениидолгого эволюционного процесса, которыйразделил бактерий и эукариот.В репликационных машинах эукариот больше белковых компонентов, чем вих аналогах у бактерий, даже при томчто основные функции у них одни и теже.
Так, например, у эукариот белок, связывающий одноцепочечную ДНК (SSBбелок) образован из трех субъединиц, тогдакак у бактерий в этом белке — толькоодна субъединица. Точно так же ДНКпраймаза эукариот входит в многосубъединичный фермент, который содержит такжеДНК-полимеразу и называется ДНКполимеразой-α-праймазой. Этот белковыйкомплекс начинает каждый фрагмент Оказаки на отстающей нити с РНК-затравки изатем продолжает РНК-затравку короткимотрезком ДНК. В этой точке в игру входятдве главные репликационные полимеразыэукариот, δ и ε, и довершают все фрагменты Оказаки, вместе с тем продлевая иопережающую нить. Как в точности задачи синтеза опережающей и отстающей нитираспределяются между этими двумя ДНК-полимеразами, еще не понятно.Как мы увидим в следующем параграфе, репликационные машины эукариотдолжны справляться с дополнительной трудностью — это репликация ДНК нануклеосомах — повторяющихся структурных единицах хромосом, о которых мыговорили в главе 4.
Нуклеосомы расположены на ДНК с промежутками примерно в200 пар нуклеотидов, чем может объясняться, почему у эукариот новые фрагментыОказаки синтезируются на отстающей нити с интервалами в 100–200 нуклеотидов,а не в 1 000–2 000 нуклеотидов, как у бактерий. Нуклеосомы могут также служитьбарьерами, которые замедляют движение молекул ДНК-полимеразы, и это можетбыть причиной того, что у эукариот репликационные вилки перемещаются со скоростью, составляющей приблизительно лишь одну десятую скорости бактериальныхрепликационных вилок.Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 465ЗаключениеРепликация ДНК происходит в Y-образной структуре, получившей название репликационной вилки.
Фермент самокорректирующаяся ДНК-полимеразакатализирует полимеризацию нуклеотидов в направлении 5’ → 3’, копируя матричную цепь ДНК с поразительной точностью. Поскольку две цепи двойнойспирали ДНК антипараллельны, синтез ДНК в направлении 5’ → 3’ можетпроисходить непрерывно только на одной из цепей репликационной вилки (наведущей, или опережающей, цепи). На отстающей (или запаздывающей) цеписинтезируются короткие фрагменты ДНК по типу «обратных стежков». Поскольку самокорректирующаяся ДНК-полимераза не способна начинать новуюцепь, для синтеза фрагментов ДНК на отстающей цепи сначала синтезируются короткие молекулы РНК-затравок, которые впоследствии вычищаютсяи заменяются на ДНК.Для репликации ДНК необходима согласованная работа многих белков.К ним относятся: 1) ДНК-полимераза и ДНК-праймаза, необходимые длякатализа полимеризации нуклеозидтрифосфатов; 2) ДНК-хеликазы и белки,связывающие одноцепочечную ДНК (SSB-белки), помогающие расплести спираль ДНК — чтобы она могла быть скопирована; 3) ДНК-лигаза и фермент,которому «поручена» деградация РНК-затравок, — чтобы сшивать дискретносинтезируемые фрагменты ДНК на отстающей нити; и 4) ДНК-топоизомеразы,призванные помочь разрешить проблемы закрученности спирали и спутыванияДНК.
Многие из этих белков связываются друг с другом в репликационной вилкеи образуют очень эффективную «репликационную машину», через которую согласуются действия и перемещения отдельных компонентов в пространстве.5.3. Запуск и завершение репликации ДНК в хромосомахМы познакомились с тем, как набор репликационных белков быстро и точнопроизводит две дочерние двойные спирали ДНК позади репликационной вилки.Но как все эти репликационные машины собираются с самого начала и как репликационные вилки создаются на молекуле двухцепочечной ДНК? В этом параграфемы обсуждаем, как клетки запускают (инициируют) репликацию ДНК и как онитщательно регулируют этот процесс, чтобы гарантировать его протекание не только внадлежащих позициях на хромосоме, но также и в должные периоды жизни клетки.Мы обсуждаем также несколько специальных проблем, которые репликационныммашинам приходится преодолевать в клетках эукариот.
В их числе необходимостьреплицировать чрезвычайно длинные молекулы ДНК в хромосомах эукариот, равнокак и сложность копирования молекул ДНК, которые связаны в тесные комплексыс гистонами в нуклеосомах.5.3.1. Синтез ДНК начинается в точках начала репликацииКак сказано ранее, двойная спираль ДНК обычно очень стабильна: две цепиДНК накрепко сцеплены друг с другом многочисленными водородными связями,образованными между основаниями обеих цепей. Чтобы быть использованной вкачестве матрицы, двойная спираль должна быть расплетена и обе цепи отделеныодна от другой, с тем чтобы неспаренные основания оказались снаружи.
Как мыувидим, процесс репликации ДНК начинается специальными инициаторными466Часть 2. Основные генетические механизмыбелками (initiator proteins), которые связываются с двухцепочечной ДНК и расклинивают две нити, разрывая водородные связи между основаниями.Позиции, в которых спираль ДНК изначально раскрывается, называют точкаминачала репликации (replication origin; рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
