Том 1 (1129743), страница 102
Текст из файла (страница 102)
В главе 4 мы узнали,что гетерохроматин представляет собой особенно уплотненное состояние хромати-Рис. 5.31 Разные области хромосомы реплицируются вразные периоды S-фазы. На этих оптических микрофотографиях показаны окрашенные митотические хромосомы, в которых реплицирующаяся ДНК дифференциально метиласьв течение разных заданных интервалов предшествующейS-фазы. В этих экспериментах клетки сначала выращивалив присутствии BrdU (аналога тимидина) и при отсутствиитимидина — с целью равномерного мечения ДНК. Затем этиклетки кратковременно инкубировали в среде с тимидиномпри отсутствии BrdU во время ранней, средней или позднейS-фазы. Поскольку ДНК, синтезируемая в присутствии тимидина, представляет собой двойную спираль с тимидином водной нити и BrdU — в другой, то она окрашивается темнее,чем остальная ДНК (которая имеет BrdU в обеих нитях),видимая в виде яркой полосы (стрелки) на этих негативах.Штриховые линии соединяют соответствующие позициина трех идентичных копиях представленной хромосомы.(Снимок любезно предоставлен Elton Stubblefield.)Глава 5.
Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 473Рис. 5.32. Применение микрочипов ДНК для отслеживания образования и продвижения репликационных вилок в геноме почкующихся дрожжей. Для этого эксперимента популяция клеток синхронизируется, так что все они начинают репликацию в одно и то же время. ДНК выделяют и гибридизируютна микрочипе; ДНК, которая была реплицирована однократно, дает гибридизационный сигнал (темнозеленые квадратики) вдвое интенсивнее, чем сигнал нереплицированной ДНК (светло-зеленые квадратики). Пятна на этих микроматрицах представляют следующие по порядку последовательности насегменте хромосомы дрожжей, расположенные слева направо, сверху вниз.
Здесь показано только 81пятно, но настоящие матрицы содержат десятки тысяч последовательностей, которые охватывают полныйгеном дрожжей. Как можно заметить, репликация начинается в некоторой точке и развивается в двухнаправлениях. Для простоты здесь показана только одна точка начала репликации. В клетках дрожжейрепликация начинается в сотнях точек, разбросанных по всему геному.на, тогда как эухроматин упакован менее плотно, что, очевидно, необходимо дляосуществления транскрипции.
Гетерохроматин, как правило, реплицируется оченьпоздно во время S-фазы, а это предполагает, что хронометраж репликации увязанс упаковкой ДНК в хроматине. Данное предположение подтверждается анализомдвух X-хромосом в клетке женской особи млекопитающего. При том что обе этихромосомы содержат, по существу, одни и те же последовательности ДНК, однаактивна для транскрипции ДНК, а другая — не активна (обсуждается в главе 7).Почти вся неактивная X-хромосома конденсирована в гетерохроматин, и ее ДНКреплицируется во время поздней S-фазы. Ее активный гомолог менее уплотнен иреплицируется на всем протяжении S-фазы.Эти данные говорят о том, что в первую очередь реплицируются те областигенома, где хроматин наименее уплотнен.
Репликационные вилки, кажется, движутся с сопоставимыми скоростями на всем протяжении S-фазы, так что степень474Часть 2. Основные генетические механизмыуплотнения хромосомы, видимо, влияет на время запуска репликационных вилок,а не на скорость их продвижения после формированная.5.3.7. У простейшего эукариота — почкующихся дрожжей — точками начала репликации служат вполне определенные последовательности ДНКПронаблюдав картину репликации хромосом эукариот, которая происходитс использованием многочисленных точек начала репликации, каждая из которыхактивизируется в определенный момент S-фазы клеточного цикла, мы обращаем нашвзор на самую природу этих точек начала репликации.
Ранее в этой главе мы узнали, что точки начала репликации точно определены у бактерий как специфическиепоследовательности ДНК, которые привлекают инициаторные белки, которые затемсобирают реплицирующие ДНК машины. По аналогии можно было бы ожидать,что в хромосомах эукариот точки начала репликации тоже будут представленыспецифическими последовательностями ДНК.У эукариот поиск последовательностей ДНК, которые несут всю информацию, необходимую для задания точки начала репликации, увенчался успехом приисследовании почкующихся дрожжей S.
cerevisiae. Для их идентификации былиизобретены действенные методы отбора, в которых используют мутантные клеткидрожжей с повреждением того или иного жизненно важного гена. Такие клеткиспособны выжить в избирательной среде, только если будут обеспечены ДНК, которая несет функционально активную копию поврежденного гена. Если кольцеваябактериальная плазмида, содержащая этот ген, будет введена в мутантные клеткидрожжей непосредственно, то она не будет способна реплицироваться, потому чтоей недостает функционально активной точки начала репликации. Однако еслив такую плазмиду встраивать случайные фрагменты ДНК дрожжей, то те редковстречающиеся плазмиды, которым довелось заполучить точку начала репликациидрожжей, будут способны реплицироваться. Клетки дрожжей, которые несут всебе такие плазмиды, способны пролиферировать, потому что они снабжены значимым для жизни геном в такой форме, что его можно реплицировать и передаватьклеткам потомства (рис.
5.33). Последовательность ДНК, идентифицированнаяпо ее присутствию в плазмиде, выделенной из таких выживших клеток дрожжей,была названа автономно реплицирующейся последовательностью (Ars). Былопоказано, что в большинстве своем эти последовательности являются истиннымихромосомными точками начала репликации, и тем самым обоснованность стратегии,принятой для их поиска, была доказана.Для почкующихся дрожжей было установлено местоположение каждой точкиначала репликации на каждой хромосоме. Конкретная хромосома, представленнаяна рис. 5.34, — хромосома III дрожжей S.
cerevisiae — есть одна из мельчайшихиз известных хромосом, с длиной менее 1/100 от длины типичной хромосомычеловека. Ее главные точки начала репликации разнесены в среднем на 30 000 парнуклеотидов; такая плотность точек должна позволить этой хромосоме реплицироваться приблизительно за 10 минут, если все они активизируются одновременно.
Какбыло упомянуто ранее, у млекопитающих точки начала репликации отстоят одинот другого значительно дальше, обычно на 100 000–250 000 пар нуклеотидов.В ходе генетических экспериментов над S. cerevisiae были проверены последствия удаления различных точек начала репликации на хромосоме III. УдалениеГлава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 475Рис. 5.33. Стратегия, принятая для идентификации последовательностей ДНК, достаточных для запускарепликации. Каждую из последовательностей ДНК дрожжей, идентифицированную этим способом,назвали автономно реплицирующейся последовательностью (Ars), так как она позволяет плазмиде,которая ее содержит, реплицироваться в клетке-хозяине без необходимости включения ее в хромосомуклетки-хозяина.нескольких из них оказывает небольшое воздействие, потому что репликационныевилки, которые начинают свой путь в соседних точках начала репликации, могутпродолжить его в те области, которым недостает своих собственных начальных точек.Однако удаление большего числа точек начала репликации ведет к потере хромосомы при делении клеток, потому что в таком случае она реплицируется слишкомРис.
5.34. Точки начала репликации ДНК на хромосоме III дрожжей S. cerevisiae. Эта хромосома, однаиз наименьших среди известных хромосом эукариот, несет в общем 180 генов. Как показано на рисунке,она содержит 19 точек начала репликации, хотя они используются с разной эффективностью. Те, чтоокрашены красным, обычно используются менее 10 % времени, тогда как те, что отмечены зеленым,работают в течение 90 % времени S-фазы.476Часть 2. Основные генетические механизмымедленно. Многие эукариоты несут избыточное число точек начала репликации,возможно, чтобы гарантировать своевременную репликацию полного генома, дажеесли некоторые точки начала репликации не справятся со своей задачей.5.3.8. У эукариот с точками начала репликации связывается большой многосубъединичный комплексМинимальная последовательность ДНК, необходимая для того, чтобы направлять запуск репликации ДНК у дрожжей S.
cerevisiae, была определена путеманализа все более и более мелких фрагментов ДНК в эксперименте, очерченном нарис. 5.33. Было установлено, что любая последовательность ДНК, которая можетслужить точкой начала репликации, содержит: 1) участок связывания крупного,многосубъединичного инициаторного белка, названного ORC (origin recognitioncomplex), что означает комплекс узнавания точки начала репликации, 2) отрезокДНК, обогащенный нуклеотидами А и T (и поэтому легко расплетаемый), и 3) покрайней мере один участок связывания белков, которые способствуют привлечению ORC к точке начала репликации ДНК (рис. 5.35).
У бактерий, как толькоинициаторный белок должным образом свяжется с точкой начала репликации,сборка репликационных вилок следует более или менее автоматически. У эукариотситуация сильно отличается из-за глубокой проблемы, связанной с реплицированием хромосом с огромным числом точек начала репликации (согласно оценке,400 — у дрожжей и 10 000 — у человека, например). При таком числе мест, вкоторых можно начать репликацию, как регулируется этот процесс, причем так,чтобы гарантировать копирование всей ДНК один и только один раз?Ответ заключается в самом способе, которым комплекс ORC, будучи связанс точкой начала репликации, последовательно активируется и дезактивируется.Эту тему мы обсудим подробно в главе 17, когда будем рассматривать клеточныемашины, лежащие в основе цикла деления клетки. Взаимодействие ORC–точканачала репликации сохраняется на протяжении всего клеточного цикла, диссоциация происходит только на короткое время — незамедлительно после репликацииДНК cамой точки начала репликации, — а ее активность регулируют другие белки,которые связываются с этим комплексом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
