Том 1 (1129743), страница 100
Текст из файла (страница 100)
5.25). В простых клетках наподобиебактерий или дрожжей точки начала репликации задаются последовательностямиДНК из нескольких сотен пар нуклеотидов. Эта последовательность ДНК содержити короткие последовательности, которые распознаются инициаторными белками,и отрезки ДНК, которые особенно легко расплетаются. Мы видели на рис. 4.4,что пара оснований A–T скреплена меньшим числом водородных связей, чем параоснований G–C. Поэтому ДНК, обогащенную парами оснований A–T, относительнолегко разъединить, и области ДНК, обогащенные парами A–T, обычно встречаютсяв точках начала репликации.Хотя основной процесс запуска репликационной вилки, изображенный нарис. 5.25, в основе своей одинаков у бактерий и эукариот, самый способ, которымэтот процесс выполняется и регулируется, отличается у этих двух групп организмов.Сначала мы рассмотрим более простой и лучше изученный пример — бактерий, азатем обратимся к более сложной ситуации, имеющей место у дрожжей, млекопитающих и прочих эукариот.5.3.2. Хромосомы бактерий, как правило, имеютединственную точку начала репликации ДНКГеном E.
coli заключен вединственную кольцевую молекулу ДНК размером 4,6·106 парнуклеотидов. Репликация ДНКначинается в единственной точкеначала репликации, и две образовавшиеся репликационныевилки движутся (со скоростьюоколо 500–1 000 нуклеотидовв секунду) в потивоположномнаправлении, пока не встретятся — примерно на полпути покольцу хромосомы (рис. 5.26).Рис.
5.25. При запуске репликационнойвилки образуется репликационныйглазок. На данной схеме представленыосновные этапы запуска репликационных вилок в точках начала репликации.Структура, образуемая на последнемэтапе, в которой обе цепи родительскойспирали ДНК отделены друг от друга ислужат матрицами для синтеза ДНК, называется репликационным глазком.Глава 5.
Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 467Рис. 5.26. Репликация ДНК бактериального генома. У E. coli надублирование своего генома размером 4,6·106 пар нуклеотидов уходит около 40 минут. Для простоты фрагменты Оказакина отстающей нити не показаны. Что происходит, когда оберепликационные вилки сходятся друг с другом в конце цикларепликации, еще до конца не ясно, хотя операция демонтажарепликационных машин предусмотрена в общем процессе.Единственная точка, в которой E. coli может управлять репликацией ДНК, — это инициация: послетого как вилки будут собраны в точке начала репликации, синтез ДНК идет с относительно постоянной скоростью до тех пор, пока репликацияне будет завершена.
Поэтому неудивительно, чтозапуск репликации ДНК тщательно регулируется.Процесс начинается, когда многочисленные копииинициаторных белков связываются с определенными участками в точке начала репликации, вклиниваются в ДНК, которая теперь обвивает их, итаким образом формируют крупный ДНК-белковыйкомплекс. Затем к этому комплексу присоединяетсяДНК-хеликаза, связанная с установщиком спирали;хеликаза размещается вокруг соседней одинарнойнити ДНК, основания которой оказались экспонированными в ходе сборки комплекса инициаторныйбелок – ДНК.
Установщик хеликазы похож на установщика зажима, с которым мывстречались выше; но у него есть дополнительная обязанность — поддерживатьхеликазу в неактивной форме, пока она не будет должным образом установлена назачаточную репликационную вилку. Будучи установлена, хеликаза начинает раскручивать ДНК, открыв достаточно одноцепочечной ДНК для того, чтобы праймазасинтезировала РНК-затравку, которая положит начало ведущей цепи (рис. 5.27).За этими событиями быстро следует сборка остальных белков и образование двухрепликационных вилок; при этом белковые комплексы движутся относительно точки начала репликации в противоположных направлениях. Эти белковые машиныпродолжают синтезировать ДНК до тех пор, пока вся матрица ДНК за каждой извилок не окажется реплицированной.У E.
coli взаимодействие инициаторного белка с точкой начала репликациитщательно регулируется, при этом инициация происходит только в том случае,если у бактерии достаточно питательных веществ для совершения полного цикларепликации. Под контролем находится не только активность инициаторного белка,но и точка начала репликации, которая только что пребывала в «периоде невозбудимости» (refractory period), который напрямую связан с задержкой в метилировании недавно синтезированных А-нуклеотидов. Дальше инициация репликацииблокируется, пока все такие А-нуклеотиды не будут метилированы (рис. 5.28).5.3.3. В хромосомах эукариот множество точек начала репликацииМы познакомились с тем, как у бактерий в единственной точке начала репликации появляются две репликационные вилки, которые движутся в противоположных468Часть 2.
Основные генетические механизмыРис. 5.27. Белки, которые запускают репликацию ДНК у бактерий. Представленный механизм былустановлен в ходе экспериментов in vitro, проведенных с использованием смесей высокоочищенныхбелков. При репликации ДНК E. coli главный инициаторный белок, хеликаза и праймаза представлены,соответственно белками DnaA, DnaB и DnaG. На первом этапе несколько молекул инициаторного белкасвязываются со специфическими последовательностями ДНК в точке начала репликации с образованиемкомпактной структуры, в которой ДНК обвита вокруг белка.
Затем хеликаза вводится в игру устанавливающим хеликазу белком (белок DnaC), который ингибирует хеликазу, пока она не будет должнымобразом установлена в точку начала репликации. Устанавливающий хеликазу белок,таким образом,оберегает хеликазу от случайного взаимодействия с другими одноцепочечными отрезками ДНК в геноме бактерии. При содействии белка, связывающего одноцепочечную ДНК (не показан), установленнаяхеликаза расплетает ДНК, тем самым позволяя праймазе войти в свои права и синтезировать затравкудля ведущей цепи ДНК. На последующих этапах (не показаны) запускаются три дополнительные цепиДНК, и в конечном счете собираются две полноценные репликационные вилки.направлениях, удаляясь от начальной точки, пока вся ДНК в единственной кольцевой хромосоме не будет реплицирована.
Бактериальный геном небольшой, и дветакие репликационные вилки могут управиться с его дублированием приблизительноГлава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 469Рис. 5.28. У E. coli задержка метилирования точки начала репликации — это период невозбудимости длязапуска ДНК. Метилирование ДНК происходит в последовательностях GATC, 11 из которых обнаруженыв точке начала репликации (и охватывают приблизительно 250 пар нуклеотидов). В метилированномсостоянии точка начала репликации связана с белком-ингибитором (Seq A, не показан), который блокирует доступ инициаторных белков к этому участку ДНК. В конечном счете (спустя приблизительно 20минут после запуска репликации) метилированные наполовину точки начала репликации полностьюметилируются ферментом ДНК-метилазой; после этого белок Seq А отделяется.За метилирование всех имеющихся у E.
coli последовательностей GATC отвечает один-единственныйфермент — метилаза Dam. Задержка в метилировании после репликации последовательностей GATCу E. coli используется также системой коррекции ошибок спаривания — для распознавания недавносинтезированной нити ДНК от родительской; так что значимые для такого случая последовательностиGATC рассеяны по всей хромосоме и не связаны белком Seq A.за 40 минут. Намного больший размер большинства хромосом эукариот требуеткакой-то иной стратегии — которая обеспечит их своевременную репликацию.Метод определения общей схемы репликации хромосом эукариот разработанв начале 1960-х гг.
Культуру клеток человека выращивают в течение короткоговремени в присутствии 3H-тимидина, так что ДНК, синтезированная в течение этого периода, несет радиоактивную метку. Затем клетки бережно лизируют и ДНКштрихом наносят на поверхность предметного стекла, покрытую фотографическойэмульсией.
Проявление эмульсии дает картину распределения меченой ДНК методом, известным под названием авторадиографии. Время радиоактивного меченияподбирают таким образом, чтобы обе репликационные вилки успели продвинутьсяпо ДНК на несколько микрометров, — тогда реплицированная ДНК в световоммикроскопе будет видна в виде полосок из серебряных зерен, хотя сама молекулаДНК слишком тонка, чтобы быть заметной.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
