Том 1 (1129743), страница 96
Текст из файла (страница 96)
Напротив, ферменты РНК-полимеразы, участвующие втранскрипции генов, не нуждаются в таком эффективном экзонуклеолитическомкорректирующем механизме: ошибки, возникающие при создании РНК, не передаются следующему поколению, и случайная дефектная молекула РНК, котораяпроизведена, не имеет никакого значения в долгосрочной перспективе. ПоэтомуРНК-полимеразы способны начинать синтез новых полинуклеотидных цепей беззатравки.Как в процессе синтеза РНК, так и в самостоятельном процессе — трансляциипоследовательностей мРНК в последовательности белков — частота появленияошибок составляет около одной ошибки на каждые 104 событий полимеризации.Такой коэффициент ошибок в 100 000 раз больше, чем при репликации ДНК, вкаковом случае ряд корректирующих процессов обеспечивает необычайную точность работы (таблица 5.1).Таблица 5.1.
Три этапа, обеспечивающих высокую точность синтеза ДНКЭТАП РЕПЛИКАЦИИЧИСЛО ОШИБОКНА НУКЛЕОТИДПолимеризация в напралении 5' → 3'1 на 105Экзонуклеолитическая коррекция в направлении 3' → 5'1 на 102Направляемое цепью исправление ошибок спаривания1 на 102Итого1 на 109Примечание: третий этап — направляемое цепью исправление ошибок спаривания — описанниже в этой главе.Глава 5.
Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 4495.2.4. Эффективное исправление ошибок возможно лишь при репликации ДНК в направлении 5' → 3'Причина, по которой репликация ДНК происходит исключительно в направлении 5' → 3', объясняется, вероятно, необходимостью получения на выходе «качественного продукта».
Если бы существовала ДНК-полимераза, которая присоединялабы дезоксирибонуклеозидтрифосфаты в направлении 3' → 5', то активирующийтрифосфат, необходимый для образования ковалентной связи, обеспечивал бы наращиваемый 5'-конец цепи, а не поступающий в оборот мононуклеотид. В такомслучае ошибки полимеризации попросту не могли бы исправляться гидролизом,потому что голый 5'-конец цепи, созданный таким образом, немедленно завершилбы синтез ДНК (рис. 5.10).
Поэтому исправить несоответствующее основаниеможно, только если оно было присоединено к 3'-концу цепи ДНК. Хотя механизмрепликации ДНК, действующий по принципу «обратных стежков» (см. рис. 5.7),и кажется сложным, он сохраняет направление полимеризации 5' → 3', котороеявляется непременным условием экзонуклеолитической коррекции.Несмотря на эти меры безопасности, направленные против ошибок репликацииДНК, ДНК-полимеразы иногда все же ошибаются. Однако, как мы увидим позже,клетки имеют еще один шанс исправить эти ошибки при помощи процесса, названного направляемым цепью исправлением ошибок спаривания (strand-directedmismatch repair). Однако, прежде чем подойти к обсуждению этого механизма,мы опишем белки других типов, которые «несут свою службу» в репликационнойвилке.5.2.5. Короткие молекулы РНК-затравок на отстающей цепи синтезирует специальный ферментДля синтеза опережающей нити специальная затравка необходима только в начале репликации: как только репликационная вилка утвердит свое существование,ДНК-полимеразе непрерывно предоставляется конец цепи со спаренным основаниеми на этот конец она добавляет новый нуклеотид.
На отстающей же стороне вилки,однако, каждый раз, когда ДНК-полимераза заканчивает короткий отрезок ДНКфрагмента Оказаки (на который у нее уходит несколько секунд), она должна начатьсинтезировать совершенно новый фрагмент на участке, расположенном далее по ходуматричной цепи (см.
рис. 5.7). Спаренную основаниями затравочную цепь, необходимую этой молекуле ДНК-полимеразы, производит специальный механизм. Этотмеханизм включает в себя фермент, названный ДНК-праймазой, который использует рибонуклеозидтрифосфаты для синтеза коротких РНК-затравок на отстающейнити (рис. 5.11).
У эукариот такие затравки имеют длину около 10 нуклеотидов исобираются на отстающей нити с промежутками в 100–200 нуклеотидов.Химическая структура РНК была представлена читателю в главе 1 и будетописана подробно в главе 6. Здесь же мы лишь заметим, что РНК весьма подобнаДНК по своей структуре. Нить РНК может образовывать пары оснований с нитьюДНК и формировать таким образом двойную спираль гибрида ДНК–РНК, — еслиэти две нуклеотидных последовательности комплементарны друг другу. Таким образом, синтез РНК-затравок направляется по тому же матричному принципу (пошаблону), что используется для синтеза ДНК. Поскольку РНК-затравка содержитдолжным образом спаренный комплементарный нуклеотид с группой 3'-OH на одномиз концов, постольку он может быть продолжен ДНК-полимеразой с этого конца450Часть 2.
Основные генетические механизмыРис. 5.10. Объяснение факта наращивания цепи ДНК в направлении 5' → 3'. Рост в направлении 5' →3', представленный справа, позволяет цепи продолжать расти, после того как ошибка в полимеризацииудалена экзонуклеолитической коррекцией (см. рис.
5.8). Напротив, экзонуклеолитическая коррекцияв гипотетической схеме полимеризации в направлении 3' → 5', помещенной слева, блокировала быдальнейшее удлинение цепи. Для удобства показана только затравочная нить двойной спирали ДНК.и дать тем самым начало фрагменту Оказаки. Синтез каждого фрагмента Оказакизаканчивается, когда ДНК-полимераза натыкается на РНК-затравку, находящуюсяна 5'-конце предыдущего фрагмента. Для того чтобы собрать непрерывную цепьДНК из многочисленных фрагментов ДНК, синтезируемых на отстающей нити,Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 451Рис. 5.11.
Синтез РНК-затравки. Принципиальная схемареакции, катализируемой ДНК-праймазой — ферментом, который синтезирует короткие РНК-затравки наотстающей цепи, используя ДНК в качестве матрицы.В отличие от ДНК-полимеразы, этот фермент можетначинать синтез новой полинуклеотидной цепи путемсоединения двух нуклеозидтрифосфатов. Праймаза синтезирует короткий полинуклеотид в направлении 5' →3' и затем останавливается, предоставляя 3'-конец этойзатравки в распоряжение ДНК-полимеразы.на выручку быстро приходит специальнаясистема репарации ДНК — она вычищаетстарую РНК-затравку и заменяет ее последовательностью ДНК.
После этого фермент,называемый ДНК-лигазой, сводит воедино3'-конец нового фрагмента ДНК с 5'-концомпредыдущего и завершает этим актом весьпроцесс (рис. 5.12 и 5.13).По какой же причине недолговечнойРНК-затравке могло быть отдано предпочтение перед ДНК-затравкой, которую не былобы надобности удалять? Довод, что самокорректирующаяся полимераза не можетначинать синтез цепей de novo, подразумевает также обратное: фермент, которыйначинает цепи сызнова, не может быть эффективен в плане самокоррекции.
Такимобразом, любой фермент, который начинает синтез фрагментов Оказаки, будетнеизбежно делать относительно неточную копию (по крайней мере 1 ошибку на105 нуклеотидов). Даже если копии, остающиеся в конечном продукте, составлялибы не более 5 % всего генома (например, 10 нуклеотидов на 200-нуклеотидныйфрагмент ДНК), то обусловленное этим возрастание общей частоты мутаций былобы огромным.
Поэтому кажется весьма вероятным, что использование РНК, а неДНК в качестве затравки дает клетке колоссальное преимущество: рибонуклеотиды в затравке автоматически помечаются как «подозрительные копии», чтобы ихэффективно удалить и заменить.5.2.6. Расплетать двойную спираль ДНК перед репликационнойвилкой помогают специальные белкиДля планомерного протекания синтеза ДНК двойная спираль ДНК передрепликационной вилкой должна быть расплетена, с тем чтобы дезоксирибонуклеозидтрифосфаты могли образовывать пары оснований с матричной нитью. Однакодвойная спираль ДНК очень устойчива в физиологических условиях; пары оснований закреплены на своих местах столь прочно, что необходимы температуры,близкие к точке кипения воды, чтобы разделить две комплементарные цепи вусловиях in vitro. Поэтому, чтобы двойная спираль раскрылась и одноцепочечнаяДНК стала доступной для копирования ДНК‑полимеразой, необходимы особыебелки.
Они бывают двух типов: ДНК-хеликазы и белки, связывающие одноцепочечную ДНК.452Часть 2. Основные генетические механизмыРис. 5.12. Синтез одного из многочисленных фрагментов ДНК на отстающей цепи. В клетках эукариотРНК-затравки синтезируются на отстающей цепис промежутками, разделенными приблизительно200 нуклеотидами, и каждая РНК-затравка имеетдлину около 10 нуклеотидов. Такая затравка вычищается специальным ферментом репарации ДНК(РНКазой H), который распознает нить РНК в спиралиРНК – ДНК и фрагментирует ее; после этого остаютсябреши (gaps), которые заполняются с помощью ДНКполимеразы и ДНК-лигазы.ДНК-хеликазы были сначала выделены как белки, которые гидролизуютATP при связывании с одноцепочечными ДНК.
Как было описано в главе 3,гидролиз ATP может циклически изменять форму молекулы белка, что позволяет белку производить механическуюработу. ДНК-хеликазы используют этотпринцип, чтобы быстро продвигаться поодинарной нити ДНК. Наталкиваясь наобласть двойной спирали, они продолжают продвигаться по своей цепи и такимобразом расклинивают спираль со скоростью до 1 000 пар нуклеотидов в секунду(рис. 5.14 и 5.15).Две цепи ДНК имеют взаимно противоположную полярность, и, в принципе,хеликаза может раскручивать двойную спираль ДНК, двигаясь в направлении5' → 3' по одной нити или в направлении 3' → 5' — по другой.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
