Том 1 (1129743), страница 97
Текст из файла (страница 97)
Фактически существуют ДНК-хеликазы обоих типов. В наиболее хорошо изученных системахрепликации бактерий хеликаза, движущаяся по матрице отстающей цепи в направлении 5' → 3', кажется, исполняет главенствующую роль — причины этогостанут нам ясны вскоре.Рис. 5.13. Реакция, катализируемая ДНК-лигазой. Этот фермент «сшивает» разрыв фосфодиэфирнойсвязи. Как показано на схеме, ДНК-лигаза использует молекулу ATP, чтобы активировать 5'-конец в разрыве (шаг 1) перед образованием новой связи (шаг 2). Благодаря этому энергетически неблагоприятнаяреакция «сшивания» разрыва осуществляется за счет сопряжения с энергетически благоприятным процессом гидролиза ATP.Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 453Рис.
5.14. Опыт для проверки ферментов ДНК-хеликаз.Короткий фрагмент ДНК отжигается с длинной цепьюДНК — чтобы сформировать небольшую область двойной спирали ДНК. Двойная спираль плавится по меретого, как хеликаза продвигается по одинарной нити ДНК,высвобождая короткий фрагмент ДНК в ходе реакции,для осуществления которой необходимо наличие и белка хеликазы, и ATP.
Быстрое скачкообразное движениехеликазы обеспечивается гидролизом связанных с неймолекул ATP (см. рис. 3.77). Многие ДНК-хеликазы состоятиз шести субъединиц, как это показано на схеме.Белки, связывающие одноцепочечнуюДНК (SSB-белки; single-strand DNA‑bindingproteins), также называемые дестабилизирующими спираль белками, связываются прочнои кооперативно с открытой одноцепочечнойДНК, не закрывая при этом оснований, которые поэтому остаются доступными для спаривания. Эти белки не способны сами расплетатьдлинную спираль ДНК, но они содействуютхеликазам, стабилизируя раскрученную однонитевую конформацию. Кроме того, благодарякооперативному связыванию они охватываюти распрямляют области однонитевой ДНК— матрицы отстающей цепи, таким образомпредотвращая образование коротких двуспиральных шпилек, каковые легко образуются в одноцепочечной ДНК (рис.
5.16 и5.17). Такие двуспиральные шпильки могут быть помехой синтезу ДНК, катализируемому ДНК-полимеразой.5.2.7. Скользящее кольцо удерживает движущуюсяДНК‑полимеразу на ДНКВ большинстве своем молекулы ДНК-полимеразы сами по себе успевали бысинтезировать лишь короткую цепочку нуклеотидов и сразу бы срывались с матрицыДНК.
Стремление быстро отделяться от молекулы ДНК позволяет молекуле ДНКполимеразы, которая только что закончила синтезировать один фрагмент Оказаки наотстающей нити, вновь быстро быть пущенной в оборот и начать синтез следующегофрагмента Оказаки на той же нити. Такая высокая скорость диссоциации, однако,мешала бы полимеразе синтезировать длинные цепи ДНК в репликационной вилке,если бы не было вспомогательного белка, который выполняет роль регулирующегоскользящего зажима (sliding clamp).
Этот зажим прочно удерживает полимеразуна ДНК, когда она передвигается, но отпускает ее, как только полимераза наталкивается на двухцепочечную область ДНК.Каким образом скользящий зажим может препятствовать полимеразе диссоциировать и в то же время не создавать помех быстрому продвижению полимеразыпо молекуле ДНК? Трехмерная структура белка-зажима, определенная с помощьюрентгенодифракционного анализа, показывает, что он образует большое кольцо во-454Часть 2. Основные генетические механизмыРис. 5.15. Структура ДНК-хеликазы. а) Общая схема этого белка в виде гексамерного кольца.
б) Схема,показывающая репликационную вилку ДНК и хеликазу в одном масштабе. в) Подробная структурарепликационной хеликазы бактериофага T7, определенная рентгенодифракционным анализом. Шестьидентичных субъединиц связывают и гидролизуют ATP упорядоченным способом для продвиженияэтой молекулы подобно ротационному двигателю по одинарной нити ДНК, которая проходит через центральное отверстие. Красные области показывают расположение связанных с ферментом молекул ATP.(Изображение б любезно предоставилEdward H. Egelman; иллюстрация в заимствована из M. R. Singletonet al., Cell 101: 589–600, 2000.
С великодушного разрешения издательства Elsevier.)круг двойной спирали ДНК. Одна сторона кольца связана позади ДНК-полимеразы,а все кольцо свободно скользит по ДНК вместе с перемещающейся полимеразой.Сборка зажима вокруг ДНК требует гидролиза ATP, что осуществляет специальныйбелковый комплекс, погрузчик, или установщик зажима (clump loader): он гидролизует ATP, когда «насаживает» зажим на стыке затравки с матрицей (рис. 5.18).На матрице опережающей нити движущаяся ДНК-полимераза прочно связанас зажимом, и так они остаются связанными долгое время.
На матрице отстающейнити ДНК-полимераза также использует зажим, но каждый раз, достигая 5'-концапредыдущего фрагмента Оказаки, полимераза освобождается от зажима и отделяется от матрицы. Далее эта молекула полимеразы связывается с новым зажимом,собранным на РНК-затравке следующего фрагмента Оказаки.5.2.8. Белки в репликационной вилке действуют сообща, образуянастоящую репликационную машинуХотя мы рассматривали репликацию ДНК так, как если бы она выполняласьсмесью белков, работающих независимо один от другого, в действительностибольшинство белков объединено в крупный и упорядоченный мультиферментныйкомплекс, который быстро синтезирует ДНК.
Этот комплекс может быть уподобленкрошечной швейной машине, состоящей из белковых узлов и приводимой в действиеэнергией, вырабатываемой посредством гидролиза нуклеозидтрифосфата. ПодобноГлава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 455Рис. 5.16. Влияние белков, связывающих одноцепочечную ДНК (SSB-белков), на структуру одноцепочечной ДНК.
Поскольку каждая молекула белка предпочитает связывать ДНК, будучи в контакте сдругой молекулой белка, ранее уже связавшейся с ДНК, на одинарной цепи ДНК образуются длинныеряды этих белков. Такое кооперативное связывание выпрямляет матрицу ДНК и облегчает процессполимеризации ДНК. «Шпилечные спирали», показанные в структуре «голой» однонитевой ДНК, образуются в результате случайного спаривания между короткими взаимно комплементарными областяминуклеотидной последовательности; они подобны коротким спиралям, которые обычно формируютсяв молекулах РНК (см. рис. 1.6).Рис. 5.17. Структура SSB-белка человека.
а) Вид спереди двух связанных с ДНК доменов белка RPA,которые охватывают в целом восемь нуклеотидов. Обратите внимание, что в этом ДНК-белковомкомплексе основания ДНК остаются на поверхности. б) Схема, показывающая трехмерную структуру,в которой цепь ДНК (красная) расположена перпендикулярно плоскости рисунка. (Изображение б заимствовано из A. Bochkarev et al., Nature 385: 176–181, 1997. С любезного разрешения издательстваMacmillan Publishers Ltd.)456Часть 2. Основные генетические механизмыРис. 5.18.
Регулируемый скользящий зажим, который удерживает ДНК-полимеразу на ДНК. а) Структура белка-зажима у E. coli, определенная методомрентгеновской кристаллографии, с добавленной кизображению спиралью ДНК — чтобы показать, какбелок образует кольцо вокруг ДНК. б) Структура состоящего из пяти субъединиц «установщика зажима»напоминает винтовую гайку, а канавки ее резьбысовпадают с бороздками ДНК. Он, кажется, сжимается вокруг затравочного стыка до тех пор, пока егодальнейшее продвижение не блокируется 3'-концомзатравки; в этой точке установщик гидролизует ATPи отпускает зажим. в) Схематичная иллюстрация,показывающая, как зажим собирается, с тем чтобыудерживать движущуюся молекулу ДНК-полимеразына ДНК.
В упрощенной реакции, показанной здесь,установщик зажима уходит в раствор, как только зажим собран. В настоящей репликационной вилкеустановщик зажима остается вблизи полимеразына отстающей нити, готовый к сборке очередногозажима в начале каждого нового фрагмента Оказаки (см. рис. 5.19). (Изображение а заимствовано изX. P. Kong et al., Cell 69: 425–437, 1992. С великодушногодозволения издательства Elsevier. Схема в взята изG. D. Bowman, М. O’Donnell and J. Kuriyan, Nature 429:708–709, 2004. С любезного разрешения издательстваMacmillan Publishers Ltd.)Глава 5.
Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 457швейной машине, репликационный комплекс, вероятно, остается неподвижным относительно своего непосредственного окружения; ДНК можно рассматривать какдлинную полоску ткани, быстро протягиваемую через нее. Хотя репликационныйкомплекс наиболее интенсивно изучался у E.
coli и нескольких из поражающихее вирусов, у эукариот, как мы увидим чуть позже, работает во многом подобныйкомплекс.На рис. 5.19, а представлена вся совокупность функций, совершаемых субъединицами репликационной машины. Находящаяся перед репликационной вилкойДНК-хеликаза расплетает спираль ДНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
