Том 1 (1129743), страница 101
Текст из файла (страница 101)
Таким образом, с помощью даннойметодики можно определить и скорость, и направление движения репликационнойвилки (рис. 5.29). По скорости, с которой следы реплицируемой ДНК растут в длинус увеличением времени мечения, темпы движения репликационных вилок оцениваютпримерно в 50 нуклеотидов в секунду. Это приблизительно одна десятая скоростипродвижения бактериальных репликационных вилок, что, быть может, отражаетповышенную сложность реплицирования ДНК, плотно упакованной в хроматин.Среднего размера хромосома человека содержит одну линейную молекулуДНК размером приблизительно 150 миллионов пар нуклеотидов. На репликациютакой молекулы ДНК от начала до конца в единственной репликационной вилке,движущейся со скоростью 50 нуклеотидов в секунду, ушло бы 0,02 секунды нануклеотид × 150·106 нуклеотидов = 3,0·106 секунд (приблизительно 800 часов).470Часть 2.
Основные генетические механизмыРис. 5.29. Экспериментальное доказательство схемы, согласно которой репликационные вилки образуются и движутся по хромосомам эукариот. Новая ДНК, синтезируемая в культуре клеток человека,кратковременно метилась в среде высокорадиоактивного тимидина (3H-тимидина). а) В этом эксперименте клетки лизировали и ДНК «растягивали» на предметном стекле, которое затем покрывали фотографической эмульсией.
По прошествии нескольких месяцев эмульсию проявили, и на том месте, гдебыла нанесена радиоактивная ДНК, появилась полоска гранул серебра. Дабы облегчить интерпретациюавторадиограммы, на этом рисунке показана только коричневая ДНК; немеченая ДНК в таких экспериментах невидима. б) Этот эксперимент проведен так же, но дополнен дальнейшей инкубацией в средебез метки — чтобы в результате дальнейшей репликации получить дополнительную ДНК, с более низким уровнем радиоактивности. Как видно на изображении б, в парах темных следов серебряное зерносходит на нет в противоположных направлениях, что свидетельствует о двунаправленном движениивилок от центральной точки начала репликации, где образуется репликационный глазок (см. рис.
5.25).Репликационная вилка, как думают, останавливается только тогда, когда встречается с репликационнойвилкой, движущейся во встречном ей направлении, или когда достигает конца хромосомы; таким вотобразом вся ДНК в конечном счете реплицируется.Поэтому, как и следовало ожидать, только что описанные авторадиографическиеэксперименты показывают, что по каждой хромосоме эукариот одновременно движется множество репликационных вилок.Дальнейшие эксперименты этого типа показали следующее. 1) Точки началарепликации, как правило, активируются кластерами, названными репликационнымиединицами, которые могут включать в себя 20–80 точек.
2) Новые репликационные единицы, по-видимому, активируются в разные периоды клеточного цикла,пока вся ДНК не будет реплицирована (к этому моменту мы еще вернемся позже).3) В пределах репликационной единицы отдельные точки начала репликации разделены между собой промежутками в 30 000–250 000 пар нуклеотидов. 4) Как и убактерий, репликационные вилки эукариот образуются парами и создают репликационный глазок, по мере того как они движутся в противоположных направлениях,удаляясь от общей начальной точки и останавливаясь только тогда, когда они столкнутся лоб в лоб с репликационной вилкой, движущейся во встречном направлении(или когда достигнут конца хромосомы).
Таким вот образом на каждой хромосоменезависимо друг от друга работают многочисленные репликационные вилки и приэтом создают две полноценные дочерние спирали ДНК.Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 4715.3.4. У эукариот репликация ДНК происходит только на одном этапе жизненного цикла клеткиВо время быстрого роста бактерии непрерывно реплицируют свою ДНК имогут начать новый круг репликации еще до завершения предыдущего. В противоположность им репликация ДНК в большинстве эукариотических клеток происходит только в течение определенной части цикла деления клетки, названнойфазой синтеза ДНК, или S-фазой (рис. 5.30).
В клетке млекопитающих S-фазаобычно продолжается около 8 часов; в клетках более простых эукариот, наподобие дрожжей, S-фаза может занимать не более 40 минут. К ее окончанию каждаяхромосома реплицирована с образованием двух полных копий, которые остаютсясоединенными одна с другой своими центромерами до начала М-фазы (М означаетмитоз), которая вскоре наступает. В главе 17 мы описываем систему управления,которая держит под контролем клеточный цикл, и объясняем, почему для входав каждую очередную фазу этого цикла нужно, чтобы клетка успешно завершилапредыдущую фазу.В следующих пунктах мы разберем, как координируется репликация хромосомы во время S-фазы клеточного цикла.5.3.5. Различные области одной и той же хромосомы реплицируются на разных этапах S-фазыВ клетках млекопитающих на полную репликацию ДНК в области, расположенной между двумя точками начала репликации, должно, как правило, уходить лишьоколо часа (учитывая скорость перемещения репликационной вилки и наибольшиерасстояния, измеренные между точками начала репликации).
И все же S-фаза вклетке млекопитающих обычно длится примерно 8 часов. Это подразумевает, чтоне все точки начала репликации активируются одновременно и что ДНК в каждойрепликационной единице (которая, как мы упоминали ранее, содержит группу изприблизительно 20–80 точек начала репликации) реплицируется в течение толькомалой части всего временнóго периода S-фазы.Случайным ли образом активируются различные репликационные единицы, или различныеобласти генома реплицируются в заданном порядке? Один из возможных способов ответить наэтот вопрос — это использовать аналог тимидина,бром-дезоксиуридин (BrdU), для мечения недавно синтезированной ДНК в синхронизированныхпопуляциях клеток, добавляя его через короткиепромежутки времени на протяжении всей S-фазы.Позже, во время М-фазы, те области митотическихРис.
5.30. Четыре последовательных фазы стандартного клеточного цикла у эукариот. Во время G1-, S- и G2-фаз клетка непрерывно растет. Во время М-фазы рост останавливается, ядроделится, и клетка делится надвое. Репликация ДНК ограниченатой частью клеточного цикла, которая называется S-фазой. G1 —промежуток между М-фазой и S-фазой; G2 — промежуток междуS-фазой и М-фазой.472Часть 2.
Основные генетические механизмыхромосом, которые включили BrdU в свою ДНК, могут быть идентифицированыпо изменившемуся окрашиванию или в реакции с анти-BrdU-антителами. Результаты показывают, что разные области каждой хромосомы реплицируются во времяS-фазы в воспроизводимом порядке (рис. 5.31). Более того, как и ожидали, анализрепликационных вилок, наблюдаемых на авторадиограммах ДНК (см.
рис. 5.29), показал, что хронометраж репликации охватывает обширные области хромосомы.Теперь существуют намного более тонкие методы для того, чтобы отслеживать запуск репликации ДНК и наблюдать движение репликационных вилок ДНКв клетках. Эти подходы основаны на использовании микрочипов ДНК — сетокразмером с почтовую марку, усеянных десятками тысяч фрагментов известной последовательности ДНК. Как мы увидим подробно в главе 8, каждый отдельныйфрагмент ДНК помещен в уникальную позицию на микроматрице и целые геномымогут таким образом быть представлены в четком порядке. Если образец ДНК изгруппы клеток, пребывающих в S-фазе, разбить на сегменты и гибридизовать намикрочипе, представляющем геном этого организма, то может быть определеноколичество каждой последовательности ДНК.
Поскольку сегмент генома, которыйбыл реплицирован, будет содержать вдвое больше ДНК, чем нереплицированныйсегмент, запуск репликационной вилки и движение вилки можно точно прослеживатьтаким способом (рис. 5.32). Хотя этот метод обеспечивает намного более высокуюточность, полученные с его помощью результаты согласуются со многими из техвыводов, которые сделаны по итогам предшествующих исследований.5.3.6. Высококонденсированный хроматин реплицируется поздно,тогда как гены в менее уплотненном хроматине, как правило, реплицируются раноКажется, что порядок активации точек начала репликации зависит отчастиот структуры хроматина, в котором эти точки пребывают.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
