Том 1 (1129743), страница 95
Текст из файла (страница 95)
5.5), говорят, что двойнаяспираль ДНК реплицируется ДНК-полимеразой «полуконсервативно». Как жесвершается сие таинство?Исследования, выполненные в начале 1960-х гг. на целых реплицирующихсяхромосомах, показали наличие ограниченной зоны репликации, которая поступательно перемещается по двойной спирали родительской ДНК. В силу Y-образнойформы этой активной области ее называют репликационной, или репликативной,вилкой (рис. 5.6). В зоне репликационной вилки многоферментный комплекс, который содержит ДНК-полимеразу, синтезирует ДНК обеих новых дочерних нитей.Часть 2.
Основные генетические механизмы444Рис. 5.4. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой. а) Как показано на рисунке, ДНК-полимеразакатализирует пошаговое присоединение дезоксирибонуклеотида к 3'-OH концу полинуклеотидной цепи,так называемой затравочной цепи, которая спарена со второй, матричной цепью. Новосинтезированная нить ДНК поэтому полимеризуется в направлении 5' → 3', как показано на предыдущем рисунке.Поскольку каждый прибывающий дезоксирибонуклеозидтрифосфат должен спариться с матричнойнитью, чтобы быть опознанным ДНК-полимеразой, постольку эта нить и определяет, который из четырех возможных дезоксирибонуклеотидов (A, C, G или T) будет присоединен. Реакция осуществляетсяза счет значительного по величине благоприятного изменения свободной энергии, что обусловленовысвобождением пирофосфата с последующим гидролизом до двух молекул неорганического фосфата.б) Форма молекулы ДНК-полимеразы, определенная рентгеноструктурным анализом.
Грубо говоря,ДНК-полимеразы напоминают правую руку, в которой ладонь, пальцы и большой палец1 «загребают»ДНК и образуют активный участок. В изображенной последовательности правильное расположениеприбывшего к месту действия дезоксинуклеозидтрифосфата побуждает пальцы полимеразы сомкнуться,что инициирует реакцию присоединения нуклеотида. Диссоциация пирофосфата вызывает размыканиепальцев и перемещение (транслокацию) ДНК на один нуклеотид, так что активный участок полимеразыготов принять следующий дезоксинуклеозидтрифосфат.Первоначально простейший механизм репликации ДНК представляли как непрерывное наращивание обеих новых цепей, нуклеотид за нуклеотидом, в репликационной вилке, по мере того как она перемещается от одного конца молекулы ДНКк другому. Но в силу антипараллельной ориентации двух цепей ДНК в двойнойспирали (см.
рис. 5.2) при таком механизме одна дочерняя нить должна была быполимеризоваться в направлении 5' → 3', а вторая — в направлении 3' → 5'. Длятакой репликационной вилки потребовалось бы два разных типа фермента ДНКполимеразы. Однако все множество ДНК-полимераз, которые открыты к настоящемувремени, может осуществлять синтез лишь в направлении 5' → 3'.Как же в таком случае наращивается цепь ДНК в направлении 3' → 5'? Сначалаответ предложили на основании результатов эксперимента, выполненного в конце1960-х гг. Исследователи добавили высокорадиоактивный 3H-тимидин к делящимсябактериям на несколько секунд, чтобы радиоактивная метка попала только в ДНК,реплицированную позже всех, в последний момент, то есть находящуюся сразу за1Оригинальное название — наладонник.
— Прим. пер.Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 445Рис. 5.5. Полуконсервативный характер репликации ДНК. Водном цикле репликации каждая из двух цепей ДНК используется в качестве матрицы для образования комплементарнойей цепи ДНК. Поэтому исходные цепи остаются неизменнымина протяжении многих поколений клеток.репликационной вилкой. Этот эксперимент выявилкратковременно существующие фрагменты ДНКдлиной 1 000–2 000 нуклеотидов, которые теперьшироко известны как фрагменты Оказаки, врастущей репликационной вилке. (Позднее, подобные промежуточные продукты репликации былиобнаружены и у эукариот, где они имеют длинувсего лишь 100–200 нуклеотидов.) Показано, чтофрагменты Оказаки полимеризуются только в направлении цепи 5' → 3' и присоединяются друг кдругу после их синтеза с образованием длинныхцепей ДНК.Репликационная вилка поэтому имеет асимметричную структуру (рис. 5.7).
Дочерняя нитьДНК, которая синтезируется непрерывно, известна как ведущая (лидирующая),или опережающая, цепь. Ее синтез немного опережает синтез дочерней нити,которая синтезируется с перерывами и известна как отстающая, или запаздывающая, цепь. В отстающей нити полимеризация нуклеотидов идет в направлении,встречном общему наращиванию цепи ДНК. Синтез этой нити прерывистым механизмом «обратных стежков» означает, что для репликации ДНК необходима лишьДНК-полимераза типа 5' → 3'.5.2.3. Высокую точность репликации ДНК обеспечивают несколькокорректирующих механизмовКак мы говорили выше, точность копирования ДНК в ходе репликации такова,что на каждые 109 скопированных нуклеотидов возникает не более 1 ошибки. Такаяточность намного выше, чем можно былобы ожидать от точности комплементарного спаривания оснований.
СтандартныеРис. 5.6. Две репликационные вилки, движущиесяв противоположных направлениях по кольцевойхромосоме. Активная зона репликации ДНК перемещается последовательно по реплицируемой молекуле ДНК, создавая Y-образную структуру ДНК, известную как репликационная вилка: два плеча каждойY-образной структуры суть две молекулы дочернейДНК, а стебель Y-образной структуры есть спиральродительской ДНК. На этой схеме родительские нитиоранжевые; новосинтезированные нити красные.
(Запредоставленную микрофотографию мы благодаримJerome Vinograd.)446Часть 2. Основные генетические механизмыРис. 5.7. Структура репликационной вилки ДНК. Поскольку обе цепи дочерней ДНК полимеризуютсяв направлении 5' → 3', ДНК, синтезируемая на отстающей нити, должна изначально синтезироваться ввиде ряда коротких молекул ДНК, названных фрагментами Оказаки. Фрагменты Оказаки синтезируютсяна отстающей нити последовательно, при этом чем они ближе к вилке, тем «новее».комплементарные пары оснований (см. рис. 4.4) — не единственно возможные.Например, с маленькими изменениями в геометрии спирали между G и T в ДНКмогут образовываться две водородные связи. Кроме того, кратковременно возникаютредкие таутомерные формы четырех оснований ДНК в отношении 1 на 104 или 105.Такие формы ошибочно образуют пару, не нарушая при этом геометрии спирали:например, редкая таутомерная форма C спаривается не с G, а с А.Если бы ДНК-полимераза не предпринимала никаких специальных действий,когда происходит ошибочное спаривание между прибывшим дезоксирибонуклеозидтрифосфатом и матрицей ДНК, то в новую цепь ДНК зачастую включался быненадлежащий нуклеотид, что приводило бы к частому возникновению мутаций.Однако высокая точность репликации ДНК зависит не только от изначальногоспаривания оснований, но также и от нескольких «корректирующих» механизмов,которые последовательно работают над исправлением ошибочных пар, периодическивозникающих в новом поколении ДНК.Первый этап коррекции ДНК-полимераза выполняет непосредственно передтем, как новый нуклеотид присоединяется к наращиваемой цепи.
Наши знанияоб этом механизме получены в ходе исследований нескольких различных ДНКполимераз, а в их числе и одной производимой бактериальным вирусом T7, который реплицируется в E. coli. Нужный нуклеотид имеет более высокое сродство кдвижущейся полимеразе, чем неверно выбранный, потому что правильное спаривание благоприятнее в энергетическом отношении. Более того, после связываниянуклеотида, но прежде чем нуклеотид ковалентно присоединится к растущей цепи,фермент должен претерпеть конформационное изменение, в результате которогоего «пальцы» сжимаются вокруг активного участка (см. рис.
5.4). Поскольку такоеизменение легче происходит при правильном, чем при неправильном спариванииоснований, это позволяет полимеразе выполнять «двойную проверку» точной геометрии пары оснований, прежде чем она решится катализировать присоединениенуклеотида к цепи.Следующая исправляющая ошибки реакция, известная как экзонуклеолитическая коррекция (exonucleolytic proofreading), имеет место незамедлительно после техредких случаев, когда неверный нуклеотид все-таки ковалентно присоединяется крастущей цепи. Ферменты ДНК-полимеразы являются чрезвычайно разборчивыми вотношении типов цепей ДНК, которые они удлиняют: они безапелляционно требуютзаранее сформированного 3'-OH-конца затравочной цепи, или праймера (primerstrand), со спаренным с матрицей основанием (см. рис.
5.4). Те молекулы ДНК,Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 447что несут некомплементарный (ошибочно спаренный) нуклеотид на 3'-OH-концезатравочной цепи, не эффективны в качестве матрицы, потому что полимераза неможет продолжить такую нить. Молекулы ДНК-полимеразы исправляют такую содержащую ошибку затравочную цепь с помощью особого каталитического участка(или в специальной субъединице, или в специальном доменемолекулы полимеразы — взависимости от полимеразы).Такая корректирующая экзонуклеаза 3' → 5' удаляетлюбые неспаренные остаткина конце затравки, продолжая это до тех пор, пока небудут удалены все ошибочновставленные нуклеотиды, чтобы восстановить 3'-OH-конец скомплементарным основанием,способный служить затравкойдля синтеза ДНК.
Таким образом, ДНК-полимераза работаеткак «самокорректирующийся»фермент, который устраняетсвои собственные ошибки полимеризации по мере своегопродвижения по ДНК (рис. 5.8и 5.9).Самокорректирующиесвойства ДНК-полимеразыполностью зависят от наличияидеально спаренного с осноРис. 5.8. Экзонуклеолитическаякоррекция, выполняемая ДНКполимеразой в ходе репликацииДНК. В данном примере несоответствие возникло из-за включения редкой неустойчивой таутомерной формыC, обозначенной звездочкой. Но тотже корректирующий механизм способен исправлять любое ошибочноевключение на растущем 3'-OH-конце.Часть ДНК-полимеразы, которая удаляет ошибочно включенный нуклеотид,представляет собой специализированный фермент, относящийся к большому классу ферментов, известных какэкзонуклеазы, которые отщепляютнуклеотиды с одного из концов полинуклеотидной цепи.448Часть 2.
Основные генетические механизмыРис. 5.9. Редактирование репликации ДНК-полимеразой. Общая схема структуры ДНК-полимеразыв комплексе с матрицей ДНК: в режиме полимеризации (слева) и в режиме редактирования (справа).Обозначены каталитический участок для экзонуклеолитической реакции (E) и реакции полимеризации(P). В режиме редактирования новосинтезированная ДНК кратковременно отходит от матрицы и полимераза претерпевает конформационное изменение, в результате которого редактирующий каталитический участок занимает другое местоположение, где и происходит удаление самого последнего изприсоединенных нуклеотидов.ванием конца затравки, и совершенно очевидно, что такой фермент не можетначать синтез de novo.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
