В. Эллиот, Д. Эллиот - Биохимия и молекулярная биология (1128701), страница 29
Текст из файла (страница 29)
гак как лля высвобождения новых вирусов и > клетки нсобхолим активный фермент. Ретровирусы Как уже отмечалось, есть чс> всртый класс олноцспочсч ных РНК-вирусов, вы зы наш>цих в настоя шсс время боль Нуклеокапснд, содержашии капснлиыс Гелии н РНК генома .Г!>вшдныи бнслой с погруженными в него силками ! Рет1к>вирус прикрепляется к рецептору клетки. н егп мембрана слижиптя г клеточной мсмбранои,высвобождая РНК в >>в> оплазму > Вирусная оболочки Клеточная >>ембрава 11итопла>м,> ф нового «цотомс > ва» роз ровирусов, а дру> ие нодвср> аются нроцсссинг у в мРНК и ис пользу к>тся для трансляции белков, необходимых для сборки вирусных часзиц.
Нрснараз А7Т азозимиднн, с>рук>ура когоро>о приведена ниже, исиолыустся лля лечсния С(!И>г(а он ингибирусз обратную> гранскрицтазу Для что>о Л7Т должен превратиться в грифосфат, являкацийся аналогом г(!ТР АКТ->рифосфа> ин> ибирусз обрвтнум> зранскригна>у, а также обрываез злою ацин> цени ДНК из-за отсутствия ЗООН > руины.
ДНК-нолик>ораза тормозится в > ора >до мсн ьшсй сто цени. 0 водородных свя>сй. Разрабоганы методы определения гибридизацнонных комплексов (см с. 233) Ъдг>вительно. по в каждом случае резровирусный онкоген, вьпывак>щий опухоль. имеет свое>о «двойника» в нормальных клетках. 'Эзо относится только к >кзонам нормальном»сна, поскольлу из-за сплайсиига форма вирусной РНК >сна нс ил>сс> ннгронов В ходе >волк>ции вирусный онко>ен, но-видимому, произошел ог овос>о клеточно>о двойника. Едгцштвенным ра>личном между ними можс> быть расхождение все> о в одно л г>сновании. Вирусный г ен обозначают нрнсгавкой «с», а соогвет- сзвукчции клезочныи ген .
црисзавьои «с» (англ с> Пн(а> 1, ! снам лаю> любоньп ныс сокращения (см Клетка с фатом лямбда инъецируняцим свонз ДН К. внутри «летки она приобретает кольцевунз форму Хрг мосома нс покрьпыс ни белком, ни какой-либо иной оболочкой (рис. 23.К). Для инфицирования аироидами растительных клеток необходимо механическое поиреждение последних (а услоаиях зкспсрнмента инфицироаанис растений анроилной Р))К проводят пузом азирания сс в листья с помощью абраптнноп> м периала).
Дейсзвие иироидной инфекции может проявляться по-разному, Лнтогтпный путь, Л! )К фага вспт~аивается в хромосому клетки и рспп( дуцируется при каке!ем е» делении .Литическии путь Д)!К фв~ в ответсг воина ~а образование новых фаговых яагтгиц в вш(с исыи((рш о, ку ш(с(иа сос (ояния р «(ава. !1о ки(- кс! (,(лес ириисс(и с(о л ! (юси( !зк »роисо((и(, и (- иричср. к (ылкчов! (к (срсвьсв,'(о а(к (и(р ш и шсс((ю, к и ич оор ((оч »ирои )ы вы(ыв и( ! йо (си(и ()с(зс(ся и! з )кои и с»осой рси и(к ио(я »ирои»(и»! !!!),. Ъи~ви(с и (ю и (и, ! (о К вир(»(лов нс и (и шиы ! сиы.
кои(!ч ю ив(с(( (ли Д (я (шо. ((ойы (»(рсзюпи (ь ! си. ысшр) юи(ии йс н»ч нз, и из» ! и о ! «рь! ! е ео рве)ье сии ! ь)изинм, !. с (шсзс.(о(ашоты(ос((, (р(п! с(ош ы(,(ирк)шпик,! (иииый , и(с (ок зл(инок»с ни (и(!ы»(с (с юн ос (ыи(с! и ко(я к (ш !зо(шов и йы (и изй(сиы (юс,(с )овз(с и»ос((и и во(- с(в(ии((с (! »иииизиии! (Риис((яиии. »ос'(с;(кюиии: римки с»и(ывзиия с)о и, коро(ки ( ис (к ! с(ои ло и»и(в) (()иисыкзс(ся.
к! »рою (кси(с;(ышя шо.(н(ш(я ш(р)( ичк!) ио(с((иии((з (с и(иски в и!» зии взс вс и ! к ик(ко(в иои) ис(ои)синю. оирс (с.(ю(»исч рзши(ис( 1!11,!! ) Вироиды .'е(.»! и(( (( П )(с)1-с!с,(соус и! К)е(( и! )!(с ! 'р!(с,((к» о1 кои()! р и!кща(к( ! р!зв)к,и(((зпшш!" 1(си()к Ьи(сйаз !()и! ((((! 1-! Р )зк )'(! (! !Ризою(ся оиис.ии(с с(ки(р(си(си (яки»сися с(р(к!) ры «ыо «»к(о Р!1!к ) Я)(ъесезе ке,е ее ею Е;.ге ъеееъ,„е,'е глава Клонирование гена, метод рекомбинантной ДНК, генная инженерия Практическое испо 1ьзованне достижений в области биохимии в ланнои кнш е специально не рассл1атриваегся. олнако ме1олы, в основе которь1л лежат манипуляции с ДНК. произвели попс гине революционные изменения в биоло1 ии и особенно в биохимии.
Г1отгол11 мы посчитали ш:лссоооразным посвят1ги, соврсл1снным мети!1ал1 молекул ярноб биолог ил отдель ну ю 1лаау Первый шаг: разрезание ДНК зндонуклеазами рестрикции Нервыи шаг при выцелснии1егш заклю ше1ся в разрезании клсточпой ДНК на опрелсленные, лостато шо малыес фра1 мси гы, с которы лш можно дальше работ;ць. '.тт а а римская нумерация используется в тех случаях, к!идя штамл1ы бактерий илзеют несколько гаких ферментов. !Зглшеупомянуз ыс фермен г ы названы соог нет стненно Егок! и Впл1!!!. Егнк! был первым фермсн юм, выделенным пз й-шталзхзв Е ггз!ь Другие фсрл~снтгя рестрикции узнакп послеловагсльносги из 4. 5 и 8 оснований г!зерменты рестрикции делают вопьюжным разрезание Д!!К в строго установленных местах, определяслзглх послсдожпсльносгями оснований, с хирур| ичсской изчнг1сггагх образуя заданные фра! менты Какова биологическая функция Коыга неметилированная в ших учасгках ДНК фага входит в клетку, для успепшо~о се инфицирования процесс мезилирования должен вьипрагь все «раунды сореннованишг у фермснга рестрикции сдинсгвенныи разрез в ДНК фша будет сопровождаться потерей его способноспз к репродукции в клезке.
'!еперь образимся к телнолглни выделения ~снов Клонирование гена, или как выделяют гены Мы выбрали лва лсетода —. генолсное клонирование и клонсйщвание кДНК. позолсу что они хороцсо иллкзсгрирунл общие принципы клонирования гена. Что такое клонирование? Клоном назынанл множество идентичных копий, образованных из однос о предшественника. Клпнирование гена или кДНК позаолясс получспь большое число копий фрагмента ДНК. Сущность каоннровання заклнсчасзся во введении участка ДНК, получешюго, например, в результате рессрикции обшей ДНК, в бактериальнущ клеску, сле он бсу- Как конструируются рекомбинантные молекулы? В основе сгос о мсз ода лежит использование «липких коннов» ДНК. Мносив ферментьс рсссрикции, например Тгсссйй осусцсссшсянсс нс прялсой разрез серез обе цепи двухцепочечнон Д! 1К, а «ступенчатый» вЂ” Х вЂ” Х вЂ” бсА — А — Т вЂ” Т вЂ” à — Х вЂ” Х— — Х вЂ” Х вЂ” С вЂ” Т вЂ” Т вЂ” А — А1б — Х вЂ” Х- есаас ...:Х вЂ”.;Х, б..., ...
А — А — Т вЂ” Т вЂ” С вЂ” Х. Х-— ! б» ': ".:". ° "",!;, „;7!. б'" "с «с "' ' '."б "б' 1:б "'" с;...'" ..'..;, "' ""„' ' ',""' -', "",' ''"', ",, "'"' " " 'й Е " ' ' „", . » а» '"-:„:.;."'.пз':ь '. ",": ':, '„:"'".;;:. ' ".",. сй;.;«с"„йсн.",;;"ч,;б'„, '„,...","-',„, ",,",»', сс"г, „",.;;,"*»"'-',': Х" ' .;,,: ",:, ."',с' б:",:: с' "' а с;с:е ". " а,'„....";„„, б. ' ';„„,," "",'"' „"' " „, "; "„;,,'! Рестрнкцнонные фрм цен гы Рестрнкцнонные фрагменты ДНК фага г. ДНК человска концы ('понз аннан ~ ибрггднзация Коли мы сможем иден гифицнровать бляшку, которая содержит фац нссупгий гребуемыи ~ен, то зго позволит вгарастигь нсограничсцное число фага в Е ~ ой и цгада:ш~ь с|о ДНК Как жс иден гифицгзрова~ь нужнюо бляшку ". Скрининг бляшек на выбранный ген человека Ддя идентификации фш а, несущс~ г1 искомый ген человека, на ибо ~ее широко используется ДНК вЂ” ДН К-г ибридизация. Для ного необкоднм зонд гибридизации.
состоящий из корогкгно фраг л~ен~а ДНК ( шиной около Фаг, содержащий рскомбинантную ДНК Инфицирование Е гой Посев инфицированной культуры клеток Перенос фиговых блан~си 'ч на чашки Неинфицированные клетки на мембрану. фиксации дйК'~ образуют непрозрачный клеточный «газон» 4 фосфа~ ная группа.
Г сли такой зонд недоступен, нспользукзт стштсрнативиые возможноеги скрининга, которые в згой кнше не расслштриваются. Рассмотрим выделение клона кДНК. Клонирование кДНК человека Создание библиотеки кДНК человека Приншш метода гаключаегся в том, что из кзегок человек И в когорых зкспрессирусгся интересующий пас инфицируя клетки Е той. затем выделить ДНК и вырезаз ь инсерты пугслз рестрикции. Даз!ьнсипзсс использование последгзнх гьзя различ ных целей почти всс~давключаст всгразиваниеинзересукнпей нас Д!1К в пру~ой клонирук>шии веки~1з наиболее часто в баьгсриальную плазлзиду Фа| Худобен дзя созлания библиотек, поскшп,ку гш может приняы большие фра~ мендоза ДНК 1около 1б ь н. н.1 и ~ффскзивгго инфицнровагь клетки, что пгззволяс~ получить полную геномную библиотеку илн комплексную библиотеку кДНК О знаки, кида дело доводит до и бчения клс1нированнш о фраг мента ~ еномнои ДНК пли кДНК, недостатколз фш а становится е~ о собзсгг~снпая большая ДНК по ферментохз рестрикции, а к молекулам кДНК,зобавляются соотнстстаукнпис липкие концы (мы не будел~ описывшь, как.зто дслаезся).
К~пал разрссангиле плазмилы и модифицироааюшя кД)!К смешиваются н лшируюгся (з. «их концы соелинянзтся фермензазианым путелз) образуклся рекомбииантиые плазмиды (рис. 24З). Во избежание излишнего усложнения рассматриваемозо процесса мы нс описываем здесь меры, предопзращаюшие восстановление исходньзх кольцсвьы ила змия и способс~аукзшие образованию рекомбинантных пль н мид Кле~кн Е сой инфицируют рекомбинангными гшазмидами и вырашиаазгз~ иа атаровых чашках таким образом, что каждая колония вырастает нз одной клетки незрансформиронанные клезки численно намни о преносходяз грансформиронаниые, нгпкен бысгрый метод тбора последних.
Одна из сконсз руированных плазмид. используехзьг~ для клонирования, рвй322; она несег всзроенныс а ес ДНК гены ус пзйчивостн к ампициллнну и гсграциклину. Каждый из згнх генов имеет )зазлззчный участок рестрикции. !1редположим, что чукерогзззый фрагмеьп ДНК астросн в геи гстрапнклина: после;пзий узко нс может управлять синзезом оелка, прн гаюшезо устоичнвость к зголзу аюигаиогикуз Клетка, иссушая такукз плазлзилу, бу.юг устойчива к ампициллину, но чувс~ визельгза к зезрациклину. Клсзка, содержгзгцая плагмиду и га же нуклеотидная последовюельность (плазмидная ДНК). Зная се, лзгзжно сигггезиров пь комплсмснтарный (олиго)иуклеотид, кот орьш и буде г служгп ь праймером. Инкубацня предназначенной для секвенирования одноцепочсчной Д11К с ираймсром, полимсраюй ! (свободной от зкзонуклеазы), г)А'!'Р, МзЗ Р.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
