Ю.А. Овчинников - Биоорганическая химия (1128694), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Реакции с брсмци«иом прокодит с образо змием промемутсч. иого циансульфоиие«ого произ«одного метио«ииа, спончаниа преаращашщегпюя е «полых уело иях в имииолактои гомос«рина, «оторый, «сеою очерееь, быстра пщролизуезся с разрывом ими«пой саяэи. П « учающийся и» С-копие псятидо«лактои и мссерина далее частично гидр«ли«устоя до щмосерина ГНбегу в результате чего ка:кдый пептидиый фрагмент, эа исключением С-коице ого. сущест«уст е двух формах . пзмосериноеой и гомосериилактоиопой. , Дц Нш етад- К гс Кю Г р йЮ-гг д ж е 'е як еа пд . и Строе «е белкое к пепе дое Ск, гс --МИ СМ вЂ” С вЂ” МН СН СО . Е» С вЂ” Пп СГ,.
Смо +,МП-СН-СΠ—- Г. с еп Болылое число методов предяожеко для распжпгмнкя белка о карбопплькой группе остатка грклгофалл. Одним кз кспользуемыз для этап цели реагепто яаляетск Н-бромсукцинпмкж мн О 1Н ГН -С~ ф НН СН СО " ~~~,— ~~ - С НН 1Н СΠ—— м Н 1 пирования. Реакции проходите» е 80"й-ной уксусгюй кислоте присутствии 2-кратгюго избьпкв о-нодозпбеизонгюй кислоты те ение 24 ч пр 20 'С, зыкод лостишет 70 -- (ОО;".. В структурны» исследованиях «»шел применение метод расгцеплеини полипептнд тй цепи идроксилвмином по с яти ар г яил- л зид цвк показали исслеловвния механизме реакции. с пгдроксиламинам азаимодейетвус циклический имид ангидрипд аспартил-глицила, образующийся из вспэрэгинил-глицилв.
Этом> иреара~цеггию способ "снует предверите ьгюе выдерживание белка а кислой среде. 5! С рое е балков н овп дов В риде сяучаеа длн расщепления белковых молекул используетс» метод чкстич ого кислотного шл(шляха. Наиболее чуастаительиымн к действию ««слог вляигтс вспвртильныо петмднме слизи.
Механизм реакции гидролизв, «ероятио. включает в себ» замегцение «врбоксильным аниагюм протонироэаннога атома азота пептидной синан: .л" су МН С НН На менее устпичиаы в кислых усновиик связи Азр Рго. Повышенная нх лабильность обусловлена тем. что атом азота остатк» прели«а а пептшп|ых связях имеет наиболыпую осноашють по сравнению с остатками других амина »слог и легче протонируется. Подобраны условия ((О „'-ввя уксусна» «пелота - — пирилин, рН 2 5, 7 М чу»надин НС(, 40 "С, 4 суток), при кспорых савв«Азр — Рго расщепляются достатечно селективно н с большим выходом (»о НУ "4, (.
СГНЛе (' СН ин с ин— 3 $ сн, СН н,о +Нк* - — " — г — ИН О 52 В 1974 г, А. Патчорипк предлгнкил метод рашцеплеиия подти«- в — пы» связей образованных остаткам цистеюм, с ~гомощью 2-иитроЬел«и пеп дь 5-тиоциагмтобеизайиой «полоты (НТЦБ1: 5СМ С мн-с(т с мн ОООН РН мО« ИюС вЂ” 5 П ...— СОПН + ММ -СЫ вЂ” С; «МН с Сму мй"; НТЦБ циаиирует остаток цистеииа, превращая его а остатп« Р-тиоцианатоаланииа, «отармй а мвгкик условиях (РН 3,0 — 9,0; 27 "С; 12 — 16 ч1 циклизуется и 2-имипотиазолидиикарбоиовую «пелоту с разрывом пептидгюй сакэя.
Расщепление полипептидиой цепи по остаткам цистенва в ухазвинмх услоаияк специфична и обычно проходит с выходом 30 — 90%. Среди апис«ивы» методов а«миме«ого расщепления яаибольшее примегмиие при исследоааиии первичгюй структуры белков ив«пиит деградация бромциаиом по попикам метиояиив.
Относи. тель«о широка гкпольэуется рвсщеплепяе по ощлткам триптофана и по саши Аю — 0(у. 3«вчитшдмо репе применяют частичный кислотный ~идрзлиз по связи Ахр — Рто и расщепление по остаткам цистеииа и тире«и«а. При расщеплении белке оо остаткам мог«они«а, триптофвгп и цистеииа обычио пбразуются «рупнме пептидиые фрапчеиты, содерплщие в среднем 40 — 30 амииокислотвых остатков, что саввам с низким сшырящвиьм этик аминокислот а белках. Более крупные пещмдм мо~ ут быть получены при рас цеплеиии свяюй Азп-01у и Ахр — Рго.
Выбор рационвльной сдемы разделения пептидов Сгр еч в белков пеп дое Разделение смес пептидных фрагмента, обрвэова шихся пр» расшеплеиии полипептидной пепи белка фермевтатиаными или химическими метод«ми, яалкетсе одним из ниболее сложггых и ответственных агапов в процессе определении первичной струк. туры. Успек иа этом этапе во многом зависит от опыта. знаний. итобрстательмн'ги исследо«втсп» и его искусства. При в боре методов разделения пептидов необходимо учитывать количества разделяемых не~цест и их физико-химические свойспм.
Одним из гюновнмх пщмметргм «властев длина полипептиднсй цепи. Методы разделении сравнительно коротких пептидов, содергквщих до !5 "- 20 «мииокислотиы» остатков, хорошо разработаны. г ! о г Прн рахэелении менее сложнмк месей (эй !5 пептидов! часто опускаетси стадия иа ообменной хроматографии. Выбор схемы разделения проводится на основании анализе так называемых пептндныи «врт». Пля получении пептмдной карги (рис.
!О! смесь пептидов, образовввшанси в результате ферментвтивного или «имического гилролизв белка, нано. тся в энде небольшой полоски не лист хроматографической бумаги или пластинки с тонким слоем целлюлозы и подвергается эле трофорезу или хроматографии «о взаимно перпендикулярных направлениях. После проявления оептидгюй карты спецнфич ым реактивом на бумаге или пластинке образуетси «арвктерныи для денного белке набор пятен, их втаимгюс расположение ппзаолнет оценить эффекти ность использован. ных ыстодов разделения и ыбрать оптимальный вариант.
и« и ю з к к л ° г ОО ем э ю ига гч.тл в а ! шф Р .го.р л л л. л«кг. Ф гш 1, нгм Бели н пептнды Значительно более трудную задачу предста»лист раза ление смесей «рупнык лепт»дон, содерлшгцих более 20 эминокисло ных остатков Основнан сл ж меть сентана со сеойст»ом таких пептидаа слипаться азад»их раствора» друг с друго иобразовы ать ысокомолекулярные агрегаты. С налью предотвращения агрегацни эбуферга е расе воры доба»ляк ге» детергенты (меч»зима, гуанидингмдроклорид, додецилсульфат натрия) . Шрк и гу и а 1 лл ру ш является также нонообменнан хроматография, в качеспм иосителек а зт с у а у а об иные цщлюлозы: дизтнламннозтнл. (ОЕАЕ)- и карбоксиметнл-(СМ)- н ионообменные полимеры деке рана.
ОЕАЕ-, СМ-, сульфозтил. (ХЕ)-, сульфопропил (ХР-)- и дизтил-2-гищ ксипропил-амииозтил- (ОАЕ-) сефадексы. ИСЦб)фэ . „т,,»е Змя г, Зл з,, ч„ле „,. г ет и «и р л з р г Ф е Ф Ф 1 Ф ,""г Ф $~Ф Ф В последние годы для ратделени» смесей пептидов очень н рока применяетс» эысокозффекти иая жидкостги» «роматографи» (ВЭЖХ) на носителях с абрашеннои фазой (рис. 12), «оторьп предстэеляют собои снликагель с «пвалентнп ярисоеднненными угщаодородами, содер «шцнми бы но 8 или 18 углеродных этими» Использустсн та«же н просто хро ап графин н» силнкягеле. Раз. деление проэодитсн с помощью специального ж цкосмюго хрома тогрвфа, а комплект которого ходит; колонки, о бым образо упа о»аниме, насос, позиоляющий со»лазать давление до 2бб а грзднентный см си е р бегаю цнй с аыс кой степенью аоспризводимости, н ыс кочунстенте ышй ультрафнощто ый нли флуоресцентный дом«тор (рис.
13) К дос оинстааи тода след)гт отнести исключительно высокую скорость разделепн (менее 1 ч), мнпроизаоднмос ь резульпщоэ и аозможность про одить аиа ипч с Р гй ° с ш аа. Особ нпо эффективно пр менени ВЭЖХ дян рэзд лс н смесей низкомолекулзр ых пелтндоа, гбразухгшнхсх при фернент юм рас (еп. енин белков Хром»татр»фии г бы но проаолитси на оло на с бр». щенной фашй С„Пру",',- он рнфторуксу гюй к л т с исполь зоаание для элюир ванна градиента ацетпнитрила. Разрешающая .пасобиость таких носителей превосходит разрешающую способность ианообменных смоа. С помощью ВЭХСХ в ряде случаен удаагсн разделить смеси высокомолекуларнык пептидов и белков.
С рое е бе ков н пеп дпе н пт . г» и гп СООН 1 СН мн ! С.= Π— О СН-СН вЂ” СН вЂ”,С вЂ” НН вЂ” СН вЂ” СН вЂ” — — Г ) / ! ы СООН О Ог хе ог— %ы „„,,„ г .за а. Згнчительгю большей химической устоичиащтью обладюот матриц ~ иа иепргаиической основе пористое стеклю «рамщзем. Тэх, ив *итииироаанном тиол-кремгюземс мокко про«од пь нммпбилита- Часто перел исследовэтелямн тктает юдаза селективного «ыделени» из сумм«рамте гидролизата белка пептьдов, несущих определенные функциональные группы, Для этих целей может быть зффе ти но иснользоаана хемоспецифическая, или ко алеитнан, хроматографии, основание» иа образовании коваленгиой с язи пептида носителем.
Чащ«сего метод коаалевт ом хроматографии применяют для селект«нного выделении пистеинсод ржаших пептидо». В основу метода положена иммебилизация пептидо х содеращ баы су ф др г ру, а с а ро анными ВК-труппами зв счет реатши типл-дисульфидного обмена, в резуль.газе «оторои между пептидам и носителем образуется дисульфидная связь (рис. 14Н При этзм пептиды, ас содержащие остатко цн е на. не связыааютсн осителем и удаляипся прн про ы а ии сооп~етстаующим буфером. Цнстеинсадер;кашне не»- гиды выдел»ил далее восстановлением дисульфидных связей нри рН б,й избыткем мерк*птоэтанола или дитиотрента.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
