Ю.А. Овчинников - Биоорганическая химия (1128694), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Б качестве носителей используются белки, не содержащие свободной и-вмилогруппы ! например. цитокром с1, или синтетические полимеры. полиорнитин и полибрен. снл сн. — и — ~снй,— н — (снй, ! сн, сн, вр г ч р ~в ш н м! г р гш г шипе ю* Б Рвстепримость пептила в органи вских растворителях резко уменьнгвется орн увеличении его юдрпфилыюсти.
Дл» повышения гьлцгофнл и ют тл а ~ ы ре» т ~ Брауницера. яасяющ с еы«о оп л р ым «нал ами фенилнзптиоцианата н "" с ° у м.=с. у Бо,н ° Бог чг г Бег ь Если на первой овадии деградации пг методу Эдмаю вместо ФИТЦ добавить реал."нт Брау нице ра, то за счет модификации г -аминогрупи значительно повысится гндрофильиость лизинспдер ашик пептидов, в результате чего оин могут успеюно аналнзироаатьс» с помощью секвеиатор». Друп|й шгр внт автоматического определения аминокислотной последовательности к роткнх пептидов снованныи на «пвалент юм присоединении их к иерастмзримому носителю. предлогксн Р.
Ларсеном. Реакционным спсулом в твердпфагиом секвенаторе служит хромать тжфич кая о. ш кв, с носителем которой ковалентно связан исследуемый пенны. Через колонку послеЮютсльнп пропускаются несбкодимые реагенты и рвстеоритсли. Присоединение пептидв к носителю «властев нредсляюшеи с алией в пЮ- цессс. Для отой цели широко «рнмевяются матрицы на основе ало пол балки и пе г ды Ф Ф .(СНрйг -. — НН вЂ” СН вЂ” СΠ—- с еило ' сг нн; »н, Нмэ !' (СНОе — НН вЂ” О( — СΠ—- э СН ННг нн ( (СН ) ) НН ) (СН,)., ) НН г (СН.,), ( мн, ч А ОООООО (ОНО (СНО э ) НН ННь э.ь ( Н.,К и(гг * ) полистирола и пористого стекла.
В «зчестее функциональной груп пы. реагирующей с пептиг(ам, обычно испальзуетс» злифатическая (араматичесиае) «миноогуопа, связанная с масителем *ногккой* различной длины. Леню мгиут быть иммабнлнзоззны бромциамоиые пептидм, содерлщюне е «и»естес Сищнцевого остатка реакг)иогщаспосабиый пактам гомвсорина( дл» полного превращен»» остатка гомасернил в лактан ани предварительно абрабагывзютсл трнфторуксусиай кислотой. и Сгк ! НН СН СО-ЫН СН О + НН вЂ” 'Р й СН;.-СН;ОН 1 '( — -нн-сн-со-мн-г н-со — нн — у Конаенсация пакта»а гамасернна с аминогруппами иосмтел» абьмно проюэдит с еы»ацам бΠ— 100'У и не со»розам»юг«» побочными реакциями.
»нелогичным пбрвзам дэи ковелеитиага при. саед»неки» пмнилав испальэуетси ликтон. образующийс» при расщеплении пептидны зе по т ткам триптобмна о н,ью Н-бромсукцинимидз илн ВНЕ-скатала (см. с. 50). Лнзинсодер:кащне пептиды присоединяются к носителю па е-иминагруппам путем конденсации с п-фенилеидимэотиоцнвнатом. ((ри этом сеяззнгюй с нгнщтлем окззмезетс» также и и-амимогруппе Н-концевого остатка оептиде.
Однако после оервога цикла догрела ции освабщк дав то я о-ам ннагру пи а и гэра го амина кислотного остатка, и процесс мажет быть продолжен обычным образом. то г Г. н — 1 — нн 1 СНг ! 3 ! СН О вЂ” Фм щн-( у — нн — с —.гат-сн.--с — нн — - — — сн-с 1 Он Сгц ~гч — СН С тон Нгм-СН вЂ” С-НН вЂ”. 1 к сг, .сн т=с -- ы -01.'3-., ь н НН г = с — г — ~ггу~ м; с =т "ьФ' нн 1 ш 1 н 1 с =з 1 тгн 1 Снг СН 1нг О - — сн.
С" ОН НН ! Сн, сн, СН, О : .Сн сц 'ОН еь и О с — снз О 1 нн.СН-.с-мну к Метод применнм такгке ддя пеленка», содеркащнх ест»тая эмин зтвлцнсте»на н аргнннна. Последние прещюрнтельно превра. щаютсн а остатка орннтннэ с помошмо гндразннолмза. Условия гндрвзмно нза являются достаточно гкссткимн (80 "С„ Ой",~ -ны» гндразн», 1О мнну, что прнаоднт к частнчному ресщепленню пептндных связей, э общий еыкод реакции присоединены» не превышает 30 550,. (1ептмдм, солергкащне цнстенн, мнут быть коввлентгю рн.
соединены к соецнальному апснтелю с помонгью реакции тнолднсульфндного пбме а (см. »ышеу. Не»болю общин вариант иммобнлизэцин пентина —. прнсоеднненне по С-концаюй «арб кснльной группе. й «ачестее конденснруквлих агентов нспсльзую шя аодараствор мыс «арбодиимнды (напр» ер, К.щтш.щ'-днметиламнноп(юпнлкарболнимнд1. двк правила, а амнногруппа пептнда предварительно защ»шкете» с помогцью легка удаляемой трет-буго снкарбоннльной группы нля ФТК-группы, образующейс» прн реакции с ФИТЦ. й отличае от перечисленных ямам метода», аыходы прн «о»»Кнсацнн с ппмощью карбоднимнд» непредсказуемы и колеблютс» а днапазоне Π— 90'й. Легче дру нх прис .едмннютсв к нос»толю короткие аргннинсгюердашне пептнды.
а' м5(- — — — со-ммз -цм — шапи балки ч лепт ды к — н с-н-к~ унг)и шлм е. (и гтм).*- к ~* — ЫЦ- — — — С шмы-БМ-СΠ— — мн сг,ооон рзм — — — с() —.и-.-см-со — мн Тнердофизиый секиенатор позволяет получать наилучшие результаты при анализе пептидоп содергкашиз от 5 ло 40 аминакнслптнык гмтеткое. Ино да он применястс» и для изучения струкзуры более крупнык пептидо» и белков, псобенно гищ фобнык, легко »ымыаеемык из реакторов г идкофэзного приб ра.
С памошью этого метсша удастся определять последовательность 20 — 25 амннокис. потник остатков. В 1001 г. Л. Худ и йб Хаииепиллер сконструироаэли и эую модель секэенатора — гвюфазный секеенатпр, предназначенный для анализа микроколичест» белкое и пептидов. В приб ре (рис. 20) исследуемый образец наносите» не нсболыппй (диаметр 10 мм) диск из пор сшго сгекляннш о шшокнэ, пропитанный полнбреном. У(осле аыгушияания диск зажим»ется мегкду двум» стекляинмми цилиндрами, бразуюшнми миниатюрную реакционную камеру (енутрен. ний объем О.М мл) (рис. 21).
Через «апнлляр э центре аеркнего цилиндра (диаметр 0,5 мм) е реакционную камеру подаипся необколимыс рыл енты (лезучн» вЂ” а газообразном состоя ни»1, «отпрые, орокодя чеши пары пмске, взаимодейстэуюг с едсорбнровамным иэ нем белком нли пептидам и палее выюдятся через капилляр а гмгкнем пнлингцм. Нековалентная нм обил тания образца на пористой пластиние, уменьшение объема реакционной камеры и соптестстеенно раскода реагентов и распшрнтелей дл» ором аок погаолили сократить до миниму а потери материала в процессе дегранации нэ эзофазнпм се венаторе и те ам з т впал знруемого пен илл или белка до )ровня )ОО 500 п оль С рое е Валко и пентчдоэ Ферментативные методы. Длэ определении структуры пептин:в и белков ма кно применить ферменты, «атализирукэцис от»цеплеиие (Ч- и С- нце ык аммнакислотнык остатков пал пептндиой цепи (амииопептилазы и щ(бокс пептиаачьц. Гидро»из пептидов с п мощью карбоксипептидаз анляетси ос поеным способом опр делении С.коны:ного остатка и С-концевой амннокисл твой псследпввтельиости.
При ис:лепоавнии структуры пептидов и белков используются карбокснпептидазы А, В, С и У. Карбоксипептилазы А (СРА) и В [СРВ) выделяют из подмелудпчной »»слезы рупнпго роют го скота, карбоксипепт дазу С (СРС) - из комуры и лис ьсе цитрусовыэ, кврбоэсип птилазу У (СРУ) — из пе«врскик дром». й. Общим треб ванием субстрат) лли всея карбокс пептидаз являетса наличие и-карб ксильиой группы у С-концсвои ам нокисэоты. Прир да бпкпаоп цепи у отщепллемо~о аминакнслптнага статэе . основной фактор, определяющий скорост идрплиза пептидн й свити На скорость отщепления С.«ниса й ам нпкнслпты в б льщой степени влияет так»ке при(юда соседнегп с гюи асхатка. Располомеиные в лн 1к а но ислатные остатки с ароматическ й или влифвтическои боковой цепью, а такие остат ки днкарбонпвыэ ам н к слог значительно ускорлют отщепление С-конце ой аминокислоты.
Напр тив, если в соседнем поло»кении накодитси глицин и прилип. с орость пццю иза снимаетси. и:ла» т эл н з Глф ь г ммм'нэс т к»Э с ль» л г С Бемг гге~гт д Мг»О, глрл Все аминокислоты по скорости птщепления их кврбоксипептидазами А и С могут быть разделены иа 4 группы (табл. «3. Оптимальное значение рН для пептидазиой активности составляет 7,0 «,0. оно меняется а зависимости от субстрата.
Твк. ск рость огшенлени Гхконцевык днкарбоновык «минакислот возрастает прн с и «ин рН, дида квк скорость птшепления лизин» епзрастае нри увс ченин рН сючше 0.0. Карб ксипептила за В «атэлнзирует отша»ление оси»нных ами- окис гт (лизина и ар инннау. Пептилна» связь, образпаэнная осгатко эрг нина. гидролизуется быстрее, чем связь, образов«ни«» оствтк м,изи а Длэ пеп нлазщгй активности оптимальное значе ие рН р » о »,0 9,0.
Кврбоксияептндазэ У отшеплнет пра тически все аминокислоты, включая пршчпгс и ее спец фнчн кчъ аналощчн» сш:цифичнп стн СРС. Гилролнз прохолит наиболее эффективно при рН 5.5- 0,5. Оптимальное значение рН югя атшеплени» лизина и эрвина — 7,0. С-К но эа» амин«с т и е» определнетс» слелующи абразомг субстрат инк>бируетса с ферментом ори 25 . 37 'С и через апределеннь|е интервалы времен» из ревкципн. яой смеси птбираютсн алик«сонме части. реакция осганавлиаастсп помгн н» и ство тшепленных «мино »слог определяется на вмипокислотном анализатор». П стропа график зависимости количества отшеплеиных аминокислот от времени <рнс.
22Н мпжнп определить С концевую п следовательность. Таким образом удается установить последовательность до 5 амииок слпзнмх остатке« Успешное пире»слепне структуры С-концевых участков пептидов и балке« в знач тельной степени зависит от рвципнального выбора фермента н условии проаедеии» процесса. Выбор карбохсипептцва. зь обус. о ил«его» приролой исследуемого пептндз. Очевидно. что при »налим тритмчсскик пептнда», «адергкагцих основные «минокислаты в «эчесгве С-концевых аст»ткав. целеспобрвзно применять СРВ или смась СРА и СРВ.
Дли идемгнф «вции С концевых остатков химогрищическнк пептидов нс» .чьзуют, кек превило, СРА. роз»на»ление С-кпнцевой последов»тельнасти фрагмента», полученных в резул тэте гидр лизэ белке протеи»евой нз ущ энгеаь, предпочтительнее проводить с помощью СРУ. Пептидг щодэзы, агщепляющие Н-концевые»минакислотнме аснмки пептидов и белка», составляют группу эминапептидаз, Н»- абкоднмым условием лля действия»минопептндвз является наличие у субстрвт» свободной а-эминагруппы. Ферменты зтай группы гидролнзуют н д пептидм. В структурнык последов»пнях белков нвнбалыпее прнманение нашли леицинеминапептилез» (ЛАП) и амннопептиллзв М (АПМ), аьшеляемме иэ почек свиньи. г пг Существует группе ферме тав, кот рые при гидрализе пептидов н белков атщепляют Н- илн С-к мцевьн дипептидньк.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
