Ю.А. Овчинников - Биоорганическая химия (1128694), страница 12
Текст из файла (страница 12)
фрагменты. К ним отнес» с» кетспси С, илн внпептипилвмин пептидаз» ( (ЛАП )), и кегепсин В, или дипептидил ербоксипептидезэ. Процесс определения вмищгкислотнай паследоветельнасти с помогцью этик ферментов состоит из несколькнх стеднйг 1) гидр лиз исследуемого соединения соат»етствующей дмпептнлдэои, 2) разделение и идентификация огшепленнык пептидов, 3) определение порядка респолпжени» дипептидое в палипеитивнпй цепи исследуемой молекулы. 4 $ф 5 1 4'® ар ий(и з, ч СРА СРВ "г "г 7О Бел н лептнд н е вчм ! Юф~ ШШШ2ИЕИШШ $ М -П~ .Су В ЧчУВ .Лнму к в ). В7всс-спектраметричсский метод.
Наряду с хнмичаскнми и фермеупвтнвмвми метелями для определения вмииакислоунаи последаивтельумсти пептидов находят примене нс физико-кимнческие метадм, е часу«асти масс-спектраметрня. та ар еув — — - -э .р в ~ а е ув у Процесс съемки масс-спектра соедннени я состонт из несколькн» сгзднй: переведение нсследу*ьюго образца а газообразное состояние; ион»зал»я его, прн «оторой происходит распад большинства образующнхся молекулярных коном ускорение полученнык ноно» в электрическом поле, последующее их разделение (е тхэ»с»мост» 71 Строе»не белков»пепл дое Х" )г,,э г .За В х,' ° х- --хг сыт Р Аиг Хе ! Ве м о»не» от отношения массы к шряду) в магнитном поле; н наконец регнстрация масс-спектра. Вследствие декстер-но»ного характера пептнды с большим трудом пад»ергаются испарению.
Лецместь ик может быть повышена путем вцнлироаанн» н атернфнкацнн. Для «цнлн. ро»анна обычно нспольлунгг трнфторуксусныя ангндрлд нли бцгпдрокснсукцнннмиднын эфир л нрной кислоты, например Леха»оной. Зтернфнквцню можно осущестанть метанолом» прнсутстзни «вталнтнческнх кол»теста хлористого сульфурнла. В ряде случаев прибегают таияе к нереметилнронанию этомоа азот» в пептнднык свят»к путем обработки ацилнрояанного лепт»да ноднстым метнлом н гидр»дом натри» днметнлсу ьфокснде. Дл» ноннзлцин нсследуемых молекул э масс-спектрометре используется несколько способов.
Традиционным методом ноннзацни яеляется бомбарднровка эле«трон»ми с знергней порндка 70 эб (рис. 24) Прнменяетс» также ионизация ультрафночетозыми лу'юмн (фотононнзацнн) или полок«тельна еарлженнымн конами (хны»чесал» нонпзацня). В поспел»ее ерема разработаны ноаые методы нанизали в сильных электрншс нх полях (палева» нонизаци» нлн полевая десарбцня). а также ноннзэцня бомбарднроа«ой ускоренными атом»ми (атомы Аг н Хе с большой кипятя»есной энергией) (рнс. 25). Прн непользования последних деух методов атпхшет необходнмостг предварительного испарения нес едуемого вещества, омо происходят одновременно с нонншцней.
В большнн тм: случае роцес е оннзацнн про»сходит «вмбнзание» элект)юное нз молекул нсоаренного шщества, в результате ыто послед»не преаращвются э положительно заряженные ионы. В молекулах лепт»доя легче »сего наннзнруютс» «арбонильные атомм кислорода и атомы азота пептидной связи. При распаде обрвэующихс» ионов преимущественна рэсщеплнкчся связи. находящиеся в Р-оп»омелин к полоагительному заряду. В результат» тако о распада из молекулярных манов промзаодных пептидов образуююя аминокислотные (А) и альлнмииные (а( фрагменты.
(д( й й й' ! + ! и СО МН СН вЂ” СΠ— МН вЂ” СН вЂ” СΠ— . — М" й — СΠ— Нгт СН Вт ! ч со — мн — Сн — сО— (э! Поскольку в процессе первоначю азой ионизации в олекулах исследуемого пептид» поломительньгй заряд окаэыщетс» тюкали. э»ванным на разных »томах кислорода или азота, прн нх дальней. шем распаде обрвзуетс» набор всех воэмогкюгх фрьгментов аминокис ощо о и альаиминного снов фрагментации (А и а(. л э., т ! а — НН СН"ЬСОЕ"ВН СН-+ Со.
Е ОМ йСΠ— МН вЂ” Снч-СО:+НН-СН ЬСО'г-- Идентификация пико» эминокнслотных н альдиминных фрэгментое в масс-спектре лает основную ин4юрмацию о стрюнии пептида (рнс. 2б(. Яминокнслотный тип фрагментации, конечно, не является еди»- огненным путем распада молекулярных ионов пмттндов. Боковые цепи каащого аминокислотного остатка вгныят свои специфические особенности в обгаую «артнну масс-спектра. Ионы срапюнтое. образугщцихся в результате специфического распада боковых цепей, дают дополнительную июрормацию о структуре пептидо». +' й О йг й' й ! !1~ ! + ° !  — СО Нн СН вЂ” С' (ЗН вЂ” СН СΠ— — 3  — СΠ— НН вЂ” Сн — СМН О + НН-СН СО-"" Одно из преимуществ масс-спектрометрнческаго метол» заключается в возможности анализировать пептиды, не содержащие свободной и вминогруппы.
устанавливать «имическую природу бюкируюгпего остатка. При испол воза«ни электронной ионизации метод пригоден для «иазизэ сравинтельно «оротких (4 †. 6 остатков) пептидов. Границы возможностей мас -спектроьн.грин в изучении структуры пептидов резко расюнрились с введением более соиременнык методов иавизации.
Применив для этой цели бомбардировку ускоренными атомами, Г. Моррис показал, что можно полу жть масс-спектры пептилпа, молекул»рная масса которы дочти~«ее ЗООО, причем лля опрецеленил структуры достаточно ( — 5 ммоль вещества, т. е. в таком случае по чувствительности масс-спектрометрический ме л ие уступает другим методам. Одним из достоинств бомбардировки ускоренными атомами, щк же «ак и полевой песорбци», является исключение стадии предварителычой модмфикации пептида. В мастоищее врем» массспектрометрия с иаиизацией бомбардира кои ускоренными атомами является одним из наиболе ярогр сениных методов анализа струк туры пептиддв средней молекулярной массы ((5 4Р аминокнслотных осгатковд Особенно эффективно использование ме и на завершающих стадиях анализ» э сочетании с пр дэаритальным после»она«не структуры понти«в иа се«вен«торе.
Прн ианизации полевой десорбцией масс-спектры пептидов состоят практически из одних молекулярных ионов. Нв этой осло ве Я. Шнмоннш«был разработан метод исслепзвани» структуры беякэ путем непосредственного «налива смеси пептидов, получаемых после ферме«тати»ного гищх лиза. Смесь пептидов подвергается дед«щади« по методу Эдмана, и после каждого зтвпв, наряду с идентифи«эциеи отщепленных аминокислот, масс-спектрометричес«и по щыекулнрным ионам определяются молекулврные массы Уу Стр , б л ов 1еп д е 'ССС СССО СХ.ОУЗ Бели и пе гиды ги Гшви з®,Г ~~ у з ~~~~~ ~ 1 ~'Ъ" 1 .ф И и «лз р лки Сдмч фу~ С'г т Я ~н з Срку ~лмг .В !а шшдеграл с Анализ расположения сульфгидрнльнмд групп и днсульфидньж связей Сульфгидрильиые группы остатков цистенна играют иамную роль в проявлении функциональной активности многих белков.
В условиях, близких и физиологическим, они являются эффектинымн иукхеофильными реагентами, обладающими высокой реакционной скосов остью. П к тому необхолимо модифицировать своболные БН-группы белк н первом этапе изучения его струк уры, пептидов (рнс. 27Ь Обработка полученных данных на ЭВМ позволяет в большинстве случаев аднозначно устанавлишть аминокис потную последовательность пептидов гиауюлишта. Метод особенно эфб:ективен при сравнительном изучении структуры мутантных белков.
Хорошие результаты удастся такме получить при использоаэими месс-спектроыетрин с ионжацией пошвой двсорбцией или бомбардировкон ускоренными атомами для анализа С-концевой послеллвательности пептилп» в спчетзнни с ферментативиым гидролизом с памошью карбоксипептидаз. то обык о цостигаегся с помощью реакции алкилирования Риодуксусной «пологой и и ее амидомР или о«попеняв надмурвэьинон кислотой до цистеиновои кислоты. Те же реакции с гюследующим количественным аивчизом образующихся ар изводи х на вминокислотном анализаторе прнмеинются и Лля пред ария. ьио з оцределемия чис а с ободнмх сульфгидрильных групп. Дл» этой цели используется также прямив т трона е бел ре м Зллмвна ~5,5'-дитио бис цй-ни робензоиная кислота) ! или дипиридилдису ьфидом, приводящее образованию смещанных уль- филов Строен в бв ков и егтидов т,э 1 При р акц н сульфгидрильных групп с змактиэом Эллмаиа образу»те» тиоиитробензайна ислотв, «оторва обладает сильным поглопмнием при 412 им и мо:кет быть определенз «оличестаемнг спектрофотометРмчески.
Дисульфидные |рупию цистина менее ревкциоиноспособны однако они . е «о в юслочнык ус овнах вступают е рщкцни дисуль. фмнно~о илн тиол-дисульфид го об е ю. Р— 3 — З вЂ” К 1 К вЂ” 3 — З вЂ” й':. Р З вЂ” 3 — й' 1 Р,— З вЂ” З вЂ” й нолекула белка. стабилизированная дисульфидиыми связями, устойчива к действию ден турнрующих эгентоа и протьолигич:- «мх ферментов. Поэта у при наличии в исследуемом белке циульфндных с»язеп необходимы и этапами работы являются ик восстановление и последующа» модификация или окисление с образо а исм стабильнык проитиодиых дистеина.
Число дисульфиднмк связей в белке определяетс» по разности суммарного содержания остатков цистеи в и количества сзободнык сульфгидрильны групп. Дисульфидные группы выполняют вазкные функции по поддерлсанию наги»пой онформации белковои мощкулы. Локализаци» поломений лпсульфидных связей иве»атея обязательным зта. по яри опрелелении первичной струнтуры белков.
Пос кякнютсльность операций иэ этой стадии следуююаж »явив е проводится ферментатинный гпаролиз кати»ного белка в услоеияк, исключающих дисуяьфндный обмен (т. е прн рн ниже 7,0), полу;синая смесь пептидо фракционируется и у выделеннмх цнстиисодермвщих фрагментов после восстановления дисульфидной связи опреде «ется ами юкис от аа последовательность. Разделе- "мК' н аг йзем пз гюс Рр. 11юту аа».О з«к НОР НО у~жусоон 1 НООС ООН 1 нн нн ! ~ + нз — сн сн-со з — з-сн сн — со ф з ние пептидов также необхолммо проводить в кислой среце. На практике лля выделения цистинсодср:каши« пептидов часта применяется метод дивгонзлышго злектрефореш (рис.
28) . По этому методу смесь пептидов наносится в центре листа хр)матографнческои бум»и). проводится злектрофоры »буфере с РН 5,6 или 6,5, полученная полоса обрабатывается парами надмуравьиной кислоты длн перевода остатков полуцистина в цнстеиновую кислоту, н затем повторна цро одитсн злектрофорез н тех лм условия», мо в перпендикулярном направлении. При пронвлении полу анной карты » н мдрииоеым реактивом пептнды, содержащие цистеиновую кислоту, биарул инаютс» за прелом«ни диагонали.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
