Ю.А. Овчинников - Биоорганическая химия (1128694), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Исследование перви ной структуры т ута тима б л ов гюзмшяет на молекулярном уро не выяснить карвктер наследств ннмх болезней. Данные по первичной структур использунпся как один из п каз. гелей при ус агювлеиин и проверив тексономиче;кик взаимоо ноюеннд м млу раз ичньми вилами ыивык ар ннизмов н построении схемы биалогическои эволюции Принцнпиальгго первич ую структуру белк но»но определвть пу ем непосредственного анализе аминонислотной последова ельносги нли путем расшифровки ну яео идной последовательное и соответствующих генов с ноьюшью геггетичес ого к дв. Ес но, наибольшую надглгиос ь обеснечивает сомтанн этик м дев.
Исследование нервичгюй с руктурм белка начинаетсн с определения его ьюлекулнрной массы, аминокислот»ого состава, И и С-коншвых ино и отиых остаткод Поскольку пока не сую. ствует метода, ыозмзляюгцего установить полную первичную структуру белка нв целой молекуле, полипептидную цепь лодыргают специфичному расшеилению кимичссхиьги реа нт ми нли иро. тэпли и ескимн фермен ами. Смесь образовавшихся пептидвых фрагментон разделяют дл» «амдого из ник опр делают амин кислотнмй состав и амин с, у с едоютельность После того «лк .труктурв всех фрагмент а уста о»лена, необколимо выяснить порядок их распело ения в ис олной оонинеп идной цепи. Для этого бело» подвергают рас милен но при п гцн другого агенгв н получаигг второн, отличный пг первого набор нептндюех фрэгменпзв„которы* разделяют и анв изирунп инала.
гн ным обраюм. Прели»ломам, ч о иссле~смый белок имеет последователносзт пр аста енную на скеме. При дсйс вии мэ него триысином гилролизуютс» связи (.уэ Уа( и Агй Бег, а при обработке бром. цианом (ВгСН) расшепляытс» связи Мег Туг и Мег й(а. Сопоставление амииокнслотнык носледопательностей бромцнауювых и трап и вских пептидов позволяет одиозна но в яснизь ик расположение вд ль полипептидной цепи белка. Обычно алк опрелелени» полной структуры белка двук нщюлизоа оказмваетс» недостаточно, причем чем влип»ее палипсптндиая цепь бгл«оюй молекулы, тем большее число различных типов расщеплении белка прикола!с» использоаэзь. бели лепт дм Бр ц в ы н -А м-оу -т*! м чьм!'.
Е:::.—:Б А! ти.м 1-гу -А -!у! ч*1-р -61у-! -м 1 Аь эь -А эуз -о~ — ч 11 «1-.т,1-м !-г! -А. -гу -ч*1-и — щу-! -Мм-ю -н -Аю — м — оы-т! Определение аминоцнслотного состава Анализ амииокислотного состава включает полный кислотими пнцюлиз исследуемого белю или пептид» с помощью 5,7 и. солююй «и лоты и коли ественное определение сох амина«молот в гидролвза е. Гищюлиз образца им!водится в юла»нных ампулак и вв«ууме при 110 С в течение 24 ч. При этом поливом ю разрушается трипгофан и частично серии„треонин, цистин и цистеин, а глу «мин и аспарвгин превращаются соотактственнп в и!утаминовую и аспарагиновую «полоты.
В то же времй пептидные связи, обраюввнные амииокислотнммп остатками с разветвленной боковой цепвю !Уа1, 11е, 1.сну, из-за стерических препятствий пщролизуются частично. Особенно стабильны скачи та! -та1, Пе"-Ие, та! — !Ю и Пе--т»1. э 6 э г! ев уг эп В! м лре ю, На заверюающей стадии исследрвания первичной струнтуры белка проводится определешге положения днсульфидных мое!ннов, если таковые имеютс». С роение бепкоа и пеп идее Р .ее* Р. юос м Л !! С Н У.-=, с 11 ~ со. ° и с..о ф Коли естеснное определение аминокислот а гндролитате белка нли септика проводится с помон!Ма амннокислотнога анализатора — прибора, разработанного в !Руб г. С. Муром и У. Стадном.
Прин!!ноиальна» скена анализатора прнеедена на рисунке 4. СООН Л ОН н!с — с — н !у С ОН и О мтр !м ° 1 с реал (!т!3-$982! Р т а У с а ! эвм В совр«мениык аминоки лотнык анализаторак надеина детектируется 1 нмаль аминокислоты, время аналию составляет 1,5-. 2 ч и весь пронесс автоматизирован (рис. 51. Для пав ипения чувствительности вместо нингидрина в ряде анализатора» применяют флуореснамин или о-фталевыи альдегив. которые при реакции с вьгигюкислотвми образуют флуаресцирую- щие саедииеии». С исподьзоааинем спсаиальнога л гектора в атом случае удаетс» регистрировать 10 -- 50 пмалей аьмиокислгмы.
О 1О Зе ЗО Ю ОО Р зк лр а н С Кн (ГМ11 З К .ирк (ЮМ— ю * л 3 сг Строен бе ьое ггеги до о,н~~ ~ ~+ Ъо, МО, но Ц Анализ М- и С-концевадд аминокислотньщ остатков б палннептиднай цепи белка с одной с оровы располопен амино«ислотнып остаток. несупгий свободную а-амнногруппу (ам»поили Н-концевой остаток), а с другои остаток со свободной п.карбоксильной группой (карбон ильиый„или С-концово» остаток). анализ онцевык остатков играет юмную роль а процессе определении анинокислотной пес «лонательности белка. На первом зтзпе исследования он Лает возмомность оценить число полищптидных цепей, составляюшик молекулу белка, и степень гомогеинос и исслецусмого препарата.
На посл дующих эта»ах с помощью анализа Н-концевых аминокислотнмх остдтков осушесталяетсн «оитроль за процессом раьиленик пептидных фрагменты Один из иервык методов опремленм Н-концевых ам»но ислотнык остапюв был предло»си Ф. Сеншром в (945 г. Прн реакции п.амнио рупп пептилэ или белка с 2, 4 дпнитрофторбензолом получаетс» Р тр ф «и.к «и (ДНФ) производное, окрашенное в агелтыи ц ет. Последующий кислотный гмщолиз (5,7 и. НС!) нриварит к разры у пептидных связей и образованию ДНФ-производного Н. онцевой аминокислоты. ДНФ-»мино пелота к тр ги русте» эфироы и нд нгмфинируетса методом тонкослойнай хроьмтографпи в присутствии стандартов. ~~~~.к ® о~~~ хй ~у Зйв '!ест Наибольшее применение для определеки» Н-конгмвык остатков в нвстоещее ерем» находи разрабо апный в )9бЗ г. В.
Греем и Б. Хавтан данс льныи мегг ). Как н метод динитрофенплщюлэнив, он основан на введении в аминогруппм белка метки, ие удалкющеис» при последуккцем гилролизе. Его первее стадия — реакция дднсилклорида ()-лиметиламиионафталин 5.сул фохлорида) с иепротонированной а-аминогрупнои лепт»да или белка с образованием данс» пентина (ДНС-пептида). ср(зе(прдв(р.гма\ мдч д *г т"" л ° т а а * к и г р. На следующей стадии ЙНС-псптнд ппцюлизуется (5.7 н. НС(, (05 "С, (2 (6 ) и псисбшклается Н-концевая О-ДНС-анино. «ислсаз.
Кроме тпго, в результате двнсилировзния боковмк групп сктатков лизина и тнрозин» могут полу»ам ся е-ДНС лизи и О-ДНС-тирозин. дНС.Аминоки«лоты об мдают интенсивной флуоресценцией в ультрафиолетовой облает» спектра (2,4 . 365 нм); обычно для их идентификации дос вт зчно О,! — 05 »моль ве цества. бели папг ды юа даз (и гмт! аг я М, !тты * Помпе время единственным методом илентификации ЙНС-ами. нокислот являлся метод микротонкослойной хроматог'рвфни. Были предло» ны паз»побратиме системы дли разделении ЙНС-аминокислот с помощью одномерной и двумерипй хрома ографии на тон«ик слоях целлюлозы.
сил» ащл (рис. 6) и гюлиамида. Однако сейчас более перспективным методом ююнтифнкаиии ДНС-аминокислот ставоеитс» емсокозффектнвная обратнофазоаа» мидкостнан крома'юграфиа с использованием флуор сцентного цетекторв, позволив»в» повысить чувс витальность дансильного метода до уровня (О н олен (рис. 7. В). Нмеетск ряд методо, с помощью историк малою Определя ь как Н-конисаой аминокислотный остаток, таг и Н-концевую аминоислотную послелоаательность К ним Относится деградация «о методу Эдмана и ферменгативнмй гилролиз аминопептидаэами. Эти методы будут пощхгбно рассмотренм а разделе, посвященнОм определению аминокислогной последаяательности пептидов.
Среди кимических методов Определения С-концевых амино. кис отнмх остатков гаслумищют внимания метод гндразинолиза, предлоащннмй С Аквбари„н огиазалонавый метод В. Матсуо. В первом из ник при нв резании псптида ил» белка с безводным пгдразином при (00 — (20 С пептиднм связи гидролизуютси с об- автова нием гндразидов аминокислот. С. Концевая аминокислота остветс» в виде свободюзй амииокислпты и монет быть амлеленв з реакционной смеси и идентифицирована. Сгро ние банное пепгндси й йт й' йз --йНЛН вЂ” б-МН-~УГ--С вЂ” МН-2М вЂ” Р ""' '-" Ынт — «Ы-~-Мн-Ыцг + о Метод и . ряд рани нна Пр г зрети л р зру н са глутамин, аспарагин, цистеин и цнстин; аргннин теряет гуанндиновую группировку с образованием орн тине. Гидразидм сорина, грюнина и лицина лабильны и легка превращаю ся в свободнью аминокислоты, то затрудняет интерпретацию резульгатоа.
Бели жл дм ы,»1б бр бобр'»рл л б р« ~лйе б бр ~р. 1ллй о.. ~ ' о~но л.у. но ~Фо Ф' нбб~ ~ни' он 1ййббйн с'"о б' й ., и . и рллй ю" лр л л сг Ср г бвмо пе. д с Гито «и сссР, л гю Фрагментация попипептидной цепи Н«обходимый эт и огйиделе~ ии псрвичн й структуры бслна— расшсиленне бел« вой мо икулы на пептидные фрзгменты. Г'груктурн я хини«бели« распола ает широким веков«лом хи и«вских и ферментати ных метода фрм оптации пшмпептнд юй пепи. Выбор о о или иного стола пределнетсн «онкретными физ ко.
имическн не ' в эу гг бе «аиобцнмстратегиче «им планом промден исследо энни. Хим вские методы обидают высокой селентнвностью, однако пр цссс ра щеплеиия проте«а т, «ак пра ило, с ы«одом, не прс ышаюпгим 50 . Этн вгоды целе о бразно использовать длл гюлу гения крупных фрз . 1ентоэ. Возомности фермеитатиэны методов пгдролнза зи чительно шире, они лак «ак рупнме, шк н мелкие ептильг. Ферментативные мети ы гидролиэа.
Нанболе» широко используемым ферментом прн усзаношинин пер и ной структуры белков ямнстся тр пс н. Коммерческий бычин грипен« получают акти зцгий его предшестгенннсл трипсин гена, ьюсляемого из секрета подгкелудочной слезы Трипсин о носится к «л осу сериновых протеи«аз и проявляет наибольшую активность диапазоне РН 7,0 -9,0.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
