Ю.А. Овчинников - Биоорганическая химия (1128694), страница 8
Текст из файла (страница 8)
цт«р нт обладает уннка иной субстратной спец фич- Чшце сего длн определении С-концевы аминокнслопгы ос вт. ко «сгюл зуют фер витати ный гидрол з к рбаксипептидашми. поз опию ций анализировать так« е и О «оицевую ино нслотную пес«едок«ты«исеть иостью. «атвлнзируя сиаровиз связей. образованных кврбокси ьними срупиамн только осиовнмк «минокнслот — лизина и арсиннзм. Бел попс«дм Р» .* а. Р мнмьимт~ ~ с и Р ' и н скт -Р лм Р ь 6 нмм~ ~Вм дм мефр * — ьут Рл Ф О си. с мкн :р уре уб р Суров иа белков пап до» и и рн у.з ищ О Вщден е заместителей бокавме цепи лизина илн аруннина препнтствуег гилрсщизу трипсином по оста «ам модифицированных аминокислот и позеслиет расщеплить белки избирательно тущька по астатрлм ар пинна или лизина соотаетстренно.
Особенно часто спользуетси модификация остатков лизина с последующим гидролизом белка по остаткам аринина. В качестве модифицирующих а ентов прмменякпси ангидридм ликврбоновмх кислот. В результат» реакции ацилироеания происходи замена полоукительиого заруцю остатка лизина на отрицвтельнмй зарял «олуамида дикарбоновой кис о ьс рн рл НН $ Нуе ' -""СМ вЂ” "С.Н С ОСУ [ Нуй Уснрф 1 —.-НН СН СО-- — нН-4Н-сО-.. В за исимости от прнродм используемого реагента модификация остзтко лизина моукет бить как обратимой, так н необратимон.
Обратимое блокирование -аминогрупп позволяет осуществлять последомпелвное расшеоление белкозой молекулы трнпсниому иначе н только по остаткам аруинина. а затем. после ртзшлеиня образоеавшнхсн пептидов н удалении защитник групп, н по остаткам лизина. Я Мстолы модификации остатков аргинииа в белках основаны из комценанюи гуаннлиновсй группы с раэлн ными анкетонамн и дивлкаепщамм.
Наиболыиее применение среди ин» находит реак. ция с 1,2-цнклогександноном, предло:кеннал в 1975 г. Л. Патти и ек смитом. модификация протекает в мягких у о тх (рн 9,0 —- 90;25 — 40 "Су в натрий-борвтном буфере с обрвзщюнием стабиг~ьнонг «смплекса проиэкоднога вргннииа с боратом. НО ОН ч I НО ОН ИН ИН н г.о Модмфицируищва группировка удалнется путем обработки 0,5 М щдроксилвмииом при рН 7,0. 37 ".С, что дют ксзмомногть проволнть послеаугощш расщепление трипсином по осаобомлающнмск остаткам аргиннна. С помощью химической модификации мщкно твклге увелнчнють число гндролнзуемых трнпснном связей.
Для этой цели, частности, нсщцп,зуется вминлэтнлированне осгатко цистеннв этнленимином (Л. Лииалеб, 1950); ИН 1 СН, СН, Смт ф П ~,„" СНг - 4~ ~~-ИН-1~-~~- "-.--, 4Н-~~ ~(-.~~-.~~-- Пентндиые с яэн. образованные «арбоксильвой груопоп 5. Драминоэтил! цистеина. явлюощегося структурным анащлом лизина, ело.сбны расщепюпьсл под действием три~юнна, однако гби(„~ин (Сб(ИИ С( ~О 1 — — ИН. СН СΠ—" ИН ИН ИН (СмтУз 1 - -ИН вЂ” СН вЂ” СО- с меньшей скоростью, чем связи, обраэоаамные остатками лязнна м вртнннн». Более полного расщепления мо)кно достичь увеличенном концентрация ферме)па и продел)кнтельностн тнщюлнза.
Нара»у с трноснноы на кодмелудочиой железы выделяют другую сернноаую протен)шзу — хнмотрнлсю. Используемыд для структурнык исследоааний о-хммотрнпснн д проявляет максимальную активность а анап»зоне РН 7,8 — 9,0. Хныатрнпсин обладает то рашо более ш яро ко 0 спец» фичносп ю; чем трипс ин. Фермент преимушестаемно катзлизмрует гндролнз оептнднык с яшй, «браэованныи «арбо снльнымн )руппами аромат»час»их вмннокмслот— тнрознна, фен»лала»»на н трнпыфан». С меньшей скоростью гидропнзуютс» пентод»же сааза лебцнма, мстноннна, )нет»»»на.
Скорость расщюлення отдельных с»язем белках н пептндах эаанснт от характера о)сел»ах аммнокнслотныя остатков. с и!3 иЫЭ а л ф.!тм!, — т) — х— — т р — х —. .— Нм х— л" "" т " ) а" "а а а Ь В последнее время прн исследо»анни пера»чнон труктуры белке» юнрокое применение нахоцнт оротеиназн нз 5)арау)ососсць ацгещ, юеделенная в 7972 т. Г. Р. Драпю, которая така)е относятся к классу сермноамх про)сна»э. фермент имеет д а максимум» протеолитнческой акты наст» - прн рН 4,0 н 7,8. Протеннаэа нз 5.
ацтецэ с аысокнм ыишом расщепляет пептндные своз», образоаанные «арбокснльной группой г)отамнноаой «нслопз Б* к лепт дь~ в Р Р в Т рны ., ыделяемый из «ультурвльной среды термофнль. ной бактерии Васй1нк Фегпюргыегеугмна, относятся к «лессу нейтральнык протеннаэ, солергкагциз цинк а качеспм кофактора. Тер ююизнн необычайно термоствбилен. е течение мсв о полностью сокрвняет свою активность при бО ьб 1рН 7.0> н теряет менее 50.1, активности при ВО Тй гд рысит устойчив в В М реет оре молении, 20 -ном растворс зтвнола или меюнола. Максимальную актненпсть он проюияет диаяазоне рН 7,0 9,0.
В с гличие т белью ноева протеолитическнз ферментов, специфичное ь термо. лизина определяется природой остатка, которому цринадлемит амиюн рупие пгдр и~изуемпй связи. Т«рмолизн» преимуюестеенно рас- цепляет пеппгдные связи. вклкмаюмне амн окислотные остатки с дрпфобнои боковой цепью (Пе, 1.ец, Ча!, Рйе, Туг, Тгр!. гр с 1и 1 вв рл 1гтта — гтагй щ епе 1 — х г"1" Х вЂ” м г Трипс»и, проте»назэ иа В. аогецз, химотрипсии и термолиэии зал»ются ферментами, наибсмсе часто используем а«гц время при установлении о«раич»ой структуры белков. Первые д» иэ иих, обладающие »«ибо»ее высокой специфичиостью, примеияютс«глазным образом для пер»и»»ого расщепления белколой молекулы, Тсрмолизии и химотрипсии обычна служат инструментом для дополиителыюи фра меигации крупных пептидов продуктов химического или фермеитатнвиого гилролиэа белка.
В то же «рема Лозольио часто опи примеияются и для первично о расщсплеии» белков небольшой и средней молекулярной массы с целью получения тперекрме«юшихся* фрагмептое. Лля избирательного расщепления ьголекулы белка по остаткам лизина или аргмиииа а последи»с подь довольно широко иепользуготс» новые ферме»ты. Среди иих тзк »азы»ломая лизин-специфичик прото»паза. выделяемая иэ рибо Агрзйапв гпейеа, и «лострипаин из С)озггщыш Ьгма!уггсош. С роек «бе ко папт доя Лизи»-снап«фи»на» прптсииаэа «основном катвлизирует рас щепление пептид«ык с»ахеи, образо»э»пик п.»ми»отру»пой лизина а хлострипаии предпочтительно пгдролизует с иэи, обраэоигнные карбоксильпои группои остатке арпгиина.
в ра пар«жени» исследователей имеется также болмоои набор менее специфич»ы» прптеолм »чаек»к ферментов (пепси», алас аза, субтилизии„папкин, про»аз« и »РЭ. Эти фермсипэ исгюль. зуэмся осиолиом »ри дацолиительнои фрам еитации лепт»до . Их субстрат»а» соецифичиость опрсдетяетс» »риродои аминакислотиых остатке ь ис толы о образу»элиз гидролизуемую слизь, ио и более улалемиых по цепи. Дл» исчерпы»«юпюго фермеиштивиого гилролнза необходимо чтобы белкова» глобула находилась в деиатуриро зипом спето»и и, т. е. все пептилиые с яэи дол «иы быть максимальи доступными дли атаки ф рмситом. В белке же, илхоляще с» а пати»пои кои формации, иак »раап»о, гидролиэу подлещ»сто» только ограииче»- вм ' с«итси, расположенных иа поаерхиоеги белковой молекулы, что пр»водит к обраэоеаиию иебпльшош числа фрагмент» . Этот процесс иэ»сете» под и«э»а»»ем оср»н»чел«ого»р гголиэе. реакции ограниченного протеолиза широки распространены э био»о и зя и осуптесталеиие целого ряда ф зиологических процессов.
В част»ости, к яиг етиосятси процессы активации э»моте»о« протеи»аз желудочно.кишечного тракта и с пиратки крови, процес ииг многих гормоио и т. п. Метод ограиичеииого протюлию получмл широкое рэспросц,«- »ение структурно-функциональных исслелояаииякбелковбольшой олекуляриой массы. б помощью ограниченного протеолиэа часто удается расщепить молекулу белка из небольшое число фрагментов и проапдить дальнейшее исследо анис их сзэюения, скоп» таким образом одну слом»у»о эшшчу исскольним бшке простым.
«патри ««щщпимь «ми с и р «фс « ис с ми ы а Е«с е »а« Р ««г ( . «ею. Хпьмчес«ие методы расюеплеиия. Срепи хи мческих методов фрагментации бел«о» наибоще специфичным и маше «сего применяемым я«««ется р«сщыщен«е бромци«иом по остаткам мг «а«пис. Метод разработан а 196! г. Э, Грассом и Б. Вщкппом и по иэбиращлыюсти деист«и« ис имеет себе равных.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
