Ю.А. Овчинников - Биоорганическая химия (1128694), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Более селеатиааого рвщелени» тиолсодерж*щих и тнолнесодержэщих пептидов можно достигнуть, если проводить ферментэтиющй или химический гидр лиз б л а, предварительно иммобилизощнного иа нерастворимом носителе. В качестве юзсителн а обоих случаях используется тиол-сафарова 4В, которвн содержит к»чесс е акти«проев»ной группы смешааны» дисульфид, образу дийс при обработке слуг«тип»-сефарозы Х2*-дипарилиллисульфидом, — о -о — ь — (сн,) нн — со — сн :; — о'г н Ьвк лгд! цию трудгюраспюрнм * ( выбран ы ) белке и ссущ«ствавгь последующий хн нческии гилролнз он ю ата Я- Ь ~, гл.ю эв Я э +ь( ~~ вевл зг э Э" ъ эн* б + д-э-в-а ц «с е ег (*о* е! у .НР ы а'э ! р н на е ! ф Сущее вукгт ак ге методы ксвален ного присоединения к носителям триптофан- и лизинсадергкащи» пептидо, оливке они приыснякпся относитекь ю редко.
Длв селектиииого выделения пептидов огки испальзова ь нммуносорбеиты, представлягощие собон антитела, кощлещгю присоединенные к нерее ворнмому полимеру-ипснтслю (2геди послед инк !июли распространение ипситслн иа основе производиык брамацсгилцеллюлазы н гелей вгароэы с «овалентво присоединенными ант телами к 2.4-динитрофсгюлу. Таяне носители прин ияк тся дли вгеделеиик функционал но ванных пептиднык фрапнситоа, содсрхгащих ревкциогв~оспщобные аыииокислотные остатки после нх сещктивного динигрофеиилироеан .
разработаны методики прнсо динеииа 2,4-динитрофеиилыкй руппы к остаткам цистеинв, мстнснина, лизина и тригпофвна. Но ые вознаыности для специфичного выделения отдельных фрагментов белка о «рылись в связи с разработкой техники монаклональнык антител (рис. !5). Иынуиосорбенты иа основе монсклоналыгых антител к различным участкам белковой молекулы могут быль использованы для селсктнаного выделения пептидн х фрагыннса, несущих антигенные дегерыинвнты этих нтител.
Поскольку э основном антнгениые детерминанты накопятся во фра ментах полипсдтндной цепи, располагающнхсл на по ерхности глобулы, нетод принснжтсн так!ко ды изучения тппографи беюгов. Определены» аминонислотной последоаательиости ан рн тд тт м- о ОН а — ~и+Он НН г, ) О н .Но зг ОН ч ! НН '' Е. Нф О+'"СО ы/ ВГН *о М-СН С О »--С,Н1 Иа первой стадии происходит присоеяиневис РИТЦ к непротонн. роеаиной ц-вмииогруппе пеотидв. йн ютк- ргнг з ха а прею глт, а р Длн уставе лс ня зминокислотнои «осщлоаатсльности белков используется соаокупгюсть химических, ферме гпатизных и физикохимнческих методов.
Н ме буруг рассмотрены те из них, которые нашли нэиболес ширпкое применение практике «труктуряой химии белка. Метов Эдмана. Основным методом определении аминокислотнпй последовательности является метод деградации пслнпептидной цепи с гюмощью фснилизоп оцив ата (ФИТЦ1, разработанный П.
Эдманом я 1950. — 1956 и; Метод Эдмагн позволяет посльдпввтельно онцсплять Н-концевыс аминнлислотнме остатки э виде фенилтиогидватоинав (ФТГ). Кандый цикл деградации «лючэет три стадии: 1> образование фсвилтиокарбамоип (ФТК)-пептида, 2) отщспление 1Ч-концевого остатка аминокислоты з форме анилинотиазолниона, 3) изпмеризац ю тиазолинона в гРТГ и ндентифн. «ацию последнего.
На игорой ставни деграданни в присутствии бежюднои сильной кислоты зобычнп трифторуксуснои> происходит отщеоление Н-концсщй амнмокислмы с образоэанием 2-агжлинп-5-тивзплиноиа м осгюбзжление о-аминогруппы последующего аминокислотипго остатка. Бе пеп иды С .СН. Н„НГ ! Нйе СН С О ! я о~гг у г ° щ у Стадх» нзомеризации состоит из даух последовательных реакций быс рый гидролиз тиа.юлигюгм и ФТК прпизэоднос вминокисл ы ци з замни едигло 3-фенил-2-тиш'идан оин. г з ~ ° ° ~ з 'с" "." Ижщификации отщсплснных ФТУ' аилие си определяющей стадией процессе дссралэции пептндоа по методу Замена. В мчание длит льгюго реыещ Л,ти атой цели исппльзо алась хр матографим на бумаге, одна о затем она была эьтссненэ друг ми более чу стеительньми и скор стнымн методами микротонхослойнор хроматографией еа силикагслс и гюлиамнле.
мидк с гои и ззож дкосгюй хроматогр фаей. Стровгме белкоа пепт дое В послед е гады анболее широкое применение дла илетпификации ФТГ находит дндкостнл хро втаграфин ысокпго разреыення на колон ах с обращенной фатой. Хрокмтг рафи проходите» О.бр о 3 а е ООН н !ц с! днс эя Б к вбпт яи «и и тббябя! ятг б Р Пиь — гчтт ин т я о аи|тртббир бария б я тип б С «Д.б б Ю Р ~тори л и О и А ! стадия деградации по методу Заманя ~~ с~-гт б ф» ~С .(~!ти! !! стадия деградации по методу Эдмана !!! стадия деградации по методу Эдмаиа ! н,!ц-Д-соон | ~дно ~-с~ " и~ЦНС~-®е ~~ф~Р~~~ф©!е либо в градиенте концентрации ацетавитрила или метанола (рис. (6), либо и изократиык условиях (в отсутствие градмеггга). Достоинствами мхтола являютсм вьюоквя чувствительность (Зов 50 пмоль), скпрость (на пдин анализ требуется менее УВ мнн), «орошая разрешающая споспбипсть и возмомность «о ичесгвеннгно определения ФЭТ.
Часто (ьзя ндентифищцн» амимокислот. отщеоляемых при деградации пептидов по методу Эдмона, используются такие масс-спектроыетрия н еминпкислотный вивлих В последнем случае анализируемый ФТГ вначале гидролизуетсл с помощью Н! до свободной аминокислоты. Срепи модификаций метода Элмаил широкое прммеиеине нашел метод сочв ающий пгюведщютельную деградацию пептидв с анализом Н.к нцеаык амине исл тиы«остатков и аиде их ланснльных пропав лных (ДНС-Эдман). По этому метоцу перед каждым циклом деградации отбнраетси определением вликвотная часть пептидв дли анализа Н-концевой амин кислоты (рнс.
(У). Достоинства метод» более высокая чувствительность определенна ДНС- выинпк юлог и меньшие потери материала иа «а:клей стадии деградации эа счет исилк ~енин экстракпии бензелем ФТК-производнык пеппгдов. Ограниченная доступность биологического материала вьь зыэает необхолимость работы с субмикроколичеставмм белков и набу д т г«у «ык олпе ру«тур мо киви за. Существует большое число аналогов ФИТЦ. которые образуют тиоги.
панщина« обладающие рядпм преимуществ ыо сравнению с Фтр. Наибольшее распространение и практике лабораторных иселедгэаний получил 4-Н,Н-днметиламинпазпбенэол-4'-изотмпци вивт (ДАБНТЦ!. Образующиес» при леградиции пептнла с ДАБИТЦ ярко-розовые 4-Н, Н-днметнламиноаэобензол.
4'-тногидантоины (ДАБТГ) имеют коэффициеигзкстннкции ( „,,-= 34000) примериовдввразвболее аьюгший, чем у ФТГ. Чувствительность илентифнкации ДАБТГ при тонкпслойной «рома огрвфии на поливммде составляет 0.0! — 0,05 нмоль (рис. (8). даьитц а! пе ф тг ф ф Рь сеи ,еЮБ и и, " ВВ Й«анги, э . )а в л длвтг- и луши е «с аг э в« и ф е Бел » пепгнд Р ь. рыг аг ) ц г а и н с» э о ш е СНэ СН ! НΠ— СН СН вЂ” ОН ) ! СНт сн 1 Сыг ) НΠ— СН СН вЂ” Он ) СН, СН, К Автоматическое опрелеленне вминонислопюй ппслеловвтельносзм. Крупным достижением в области структур ых неслед ваннй белков явилась с здание а )967 г. П.
Эдывиом н д к. Бамом секвенатпра -- прибора. кптерый с высокой эффективностью осушествлнет п следовательное автоматическое отщепление Н-концеаык аминокислотных остатков по метолу Эцмлнн. В секвенаторе есе реакции прпаолатсв а цнлиндричесиом стеилянном отака чике (рис. )9). ерашающемс» с постоянной скорпстью в атмссйпре инертного газа. Исслецуемын обрэюцбелка нан сигея а виде тонкой шзе «н иа стенк» ствканчика, а реактивы и растворителя по шлангу одаютси на его днп.
За счет центробежной силы пнн лепнина ютг н пп стенкам, с прикасаются с пленкой бенка, ютем собираютсн в .пециелы«и канавке в верхней части стаканчика и у)шляются пп птвпдному шла гу, Больша» лавер«мыть сспрнкосноаени мслду двумя фазам способствует легкому проникновению реагентов с воль пленку белка, быс;рому протеканию реакций и беспрепятственной экстракцни пр дуктов реакции. В секвенаторе исключен «о»такт анализируемого пбразца белк» с «ислп)юдом воэцухе н стеидартнэпаа»Ы условна праведе ия ашк .талии реакции Нарнцу с тщательной очнстк я испальзуемык реагентпв и растворителей, это позволяет проводить автпматиче.
ге . » н с ог ш мтаткоесме д 95 С Вля предотвращения испарение реагентов в бо ш ц объем реакционного стаканчике в качестве гжноаа ни» е реакции присоединение применяют шюдрол — - (Н,Н,НСН'-тетракисоргндроксипропи ) этнлендиамни, а в реакции отщепления афтор иую кислоту, обладающие пониженной летучестью, В секаешпоре ороаодн.гсв только первые лве стадии реакци» Эдмана - присседищнне и отщеоленне. Образовавшиеся в результате анилннотназолннпиы экстрэгируюгся н собир»юге» в кпллекюре фракций. Ик преврагцение в ФТГ осущесталяется вручную или с помощью авт магической приставки — «онвертерв. Наилучшими объект»ми для гкидкпфвзнпго секвенатора я ляюся б:лки и пептнды, с аержещне в смюм сосчаш от 60 до 200 амишь «ис отны остетков.
Вл» гшх обычно увлечен определять последовательность 50 - 50 остатков. При исследовании более «рупных бе. к а е процессе деградации наблюдается значительнын гидро нз лабнльных пептидных связей «нутрн полипептндиых це мй. С дру пю стороны, короткие пептилы. особенно пептиша, солержащие в сюем составе гиррофобн вм ки«л тнье т тк, ннтегкиано вымываются нз стакэнч кэ секеенатпЮ. Дли предотвращения такое рода потерь пептидов разраб тан рял методичес х прием в. Одия из ник предусматривает д бавление з реакционную камеру спец альных носителей, препятсгвуюпсик механическплгу удалению пептнда.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
