Ю.А. Овчинников - Биоорганическая химия (1128694), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Б пе гид Стратегия и тактика исследования первичной структуры белков Стратепгя нзучени» первичной структуры бел«а, особенно на первых этапах, всецело определщтс» его аминокислотиым сост»- вом и моле у грной массой. Дзльнейшии плен исследования зависит от получе ых результатов и до оке« подвергаться постоянной «аррекцни. Стратегические принципы изучения первипюй структуры белк» претерпевали значительшае изменемин по мере раз нтня и усовершенствования пр«меняемых методов.
Следует отметить трн основны этапа и рвзюмии. Первый этап начался с «гмссиче «ой рабаси Ф. Сантера ()953) по усшношгению лмннокислотнай последовательности имсулнив, горой — с широкого введения а структурный анализ белка автоматического сенэенаторз ()мчало 70 х годов> и, «»коне)ь т(мтий с разработки скоростны методов анализ» нуклеотианои после'юв»тельности днк (л. максам, В. гилберт, Ф, Сентер, начало 80-х годов>. В «лвссичесхих работах 60-х — начала 70- годов лля расщеплены» белке ис)юльзоевлись глазным образом такие методы, «о торце позволя и получать больнюе число фра ментов небольшого размере.
Структура их «зучащсь классическими методами анализа (ручнои метод Эдмана, ДНС-Эдмвн, расщепление карбоксипептидазами и «минопептидаз мн). При этом лля сновн го ндр иза применялся глаенмм образом грипен«, э лля получения перекрынающнх н пептидов также нспользона ись фермснтати ные методы гидролита (~ имотрипсин, термолнзин и пенсии). С понвлснмем в лабораториях секвензтора для расщепления белка т» н прим нят химическ е методы, пазволякецне получать крупные фрагменты; расгцепление по остаткам метионнна— бромцнаном, три птафана — В Н Рб-скатовом, по связи асларнгинилглицнл — гидроксигммнном. Из фор енщтинных методов чаше нспользонвлсн пнцюлиз трипсином белка, модиф«цироаанио о по остат«лм лизин», а также п)дролнз тафигюко «оной протеиназои. Такой подход исключал кропотливую раба.
у гю выделению и установлению структуры большого числа мелки пептидов, что поз»ели о о ммнмх случаях резко ускорить п(юведение исследоваю)й. НСООН е Н О Р 2а.а а «) Р « д ю)м м « ):ф*рю В Р Р Р Р 'ЦР Р М ° ГЛЕ«Р г, е в.ы л Р )ч)2) 74 4 р Р 4 .444, 4 сс с с ' 4« '. с~ — 64 с — 4~ .р с .. -с с 44 Б ..-44 с ° .в.с-в....ссв.
с рв в.рс Г,.::=,.—,: .:;„;;: —.=: —;:=.—:;=;:::;:. с с сс * ~-"--'- —" — ""'-"='",—;='-' — '"'— '"-"-" —"--"' " — "-' '- —,;„— '*' '— '"-- " '= —" — '"- .4ВС .. 78 БЕПИИ Пвит ДМ В изучении перви иой структурм белков достигнут значительный просресс. Езкегоаио >стаиавлиаается поливе структура около )ОО поем! белков.
Определе м «мим>кислотные последовательности таких сложных фермеитщь как гликогеифосфэрилаза и й-галактозидаэа, содержащих соответственно Ве! и )02) амииоислотимк остапов в одной полипептидиой щпи. Нариду с этим ).л ° ° 119)щ т 1М ИМ В !е 193!), е« -б Р .О Р и апра е хе !г Оз МИ ОН лассо!:йп !Щ 2 Ра и Вейм и *192 1бб мт тва 91 119 г с Е: х.)) )ИИБ 3 Р ннпн ! л. си)аз а) 19о !сп 4 гор Р лощдй1оаиз а.ре р! . щв в свч * структурной к бе а ас е(се рема нмеются определен. ° ыс проблемы.
Наибольшие сложности озннкают у исслсдовате. .е», имеющих деле с мембраны мн белкамн, белками, выделяемыми в ничтож о малых ч, бс бо ш ' еку парно» мзссм (М д (00 606) При изучении ымб)»нных белков необходимо прн имать о вы»манне присущие нм нсобы нме свойства, Высокое сродство эти белков к лип»дам н гндрофобносзь при одят к практически полной нх е(жстнорньюстн в водны среда П п ндные фраг ентм, полученные прн »дроли е мембранных белков,та з е плохо раствори мы и облада~от но»ма~та ти склонностью к агрсгацин.
Эти н некоторые другнс слом~о тн встретились прн ксследовв и» структурм бактернородопсин» вЂ . ос овного белка пурпурное мембраны галофнльнон бактерии На>оЬас!епшп Ьа>ой)ош Уменьшение «олнче тв балков и псщидост необходнмь х лля анализа нх структуры, наляет я однон из центральных проблем, стоящих перед нсследователвмн.
С целью сере ения ве»етс» пояс« на ых метода» нзу с»на структуры, в частности более щнствитель ны способо ид нтнфикацнн производных аминокислот (см.с. 61). Один нз перспсктннных подходов включается в широком нспользо анни радноа твен и методов аналиш В ряде л»Гюраторнй прн л р ! 1 зб- нли ' С-ФИТЦ. Можно вгюлнть рвдноакт»аную метку непосредственно а ал знруемык бс о Дл ног нх б«лков это аост»гастевн добввленнем рад оак о к слог нспосред.
огненно в питательную .Реду, а «атпрой аырзщиваетс» культура, являющаяся источннком исследуемого белка. Таким же пуп:м ока вы»естся возможным Р дноавтнвно мстить белок нэбнрательно по о»реяелемным аминокнслотным остаткам Если белок, радио» т вне меченный, напри ер, по остаткам ленцнна, аналмзировать с помощью сс енатора, »з простое изме(мнне радноактивностн экстрактоц садержан)их энилннотназо иноны, озвол ет безошнбочно оыределнть, а вкмх ~юложенияк полнпептидной цепи в Н-ко цеаой об астн белка расположены ост»тки ленцнна (рнс. 31). йнзлогнчным образом можно опреде ить поло1кенне и друг»к ам»»окне потных остатков Такой прием кспользуетс» для »налива Н-концевой последовательности предшсственннко белков, доступных лишь в ннчпнкно малмх колмчестаах.
Для исследования полной структуры ан. однако, не применяется из-зз дороговизны п трулоемкостн. Особые задач» коза»кают прн исслсцованнн первичной структуры сверхкрупных белков (молекулярная масса бол (ООООО), поскольку с ростом молекулярной масси все слозкности увелнчнваютс» геометрической прогр сснн. Одни нз возможных подходов в этпм случае эа етс по зова ми огр ничснного протеолнза лля рзсще~ле хоцног белка на небольшое число фрзгме тов средней молекулярной масси (20 ОСО .
40000> н в посщдующем ксследаваннн фрэгментоа «ак отдельмык бслаов. Зтот прием был нспальзоааи прн определении структуры фактора элонгасмн биосинтез» белка ЕР С (Н). В. 6»акое и др., 1976). Инкубнроеэнне ЕР С (М 81000> а нативнам состоянии с трипс»но» привод» к образованию четырех сравнительно устончнвых к дальнейшему действню трипс»на фрагмента Т ТьТь н Тг (М 4! 660, 27 000, 8000 и ЗООО ссюгеетстаен о> Фра менты былн выделены в ~ омогенноы виде, установлено их строение н расположенке а полнпептнднои цепи белка (рнс.
32). Раз»изме методов аналнза нуклеотндной по«ледоаательностн ДНВ сделало возможным на о нове генетического кода а водить сооткстст ующне амннокнслотныс последоаатс ьностн нсходя нэ установленных нуклеотнднык. При рсжтиэацни такого подхода С рое не белковн пептндо» !ф ф "с!. + ''Й Б« ! ' ! "сж )-аы ° ш л и т ел атг т 3 з э з т в е о!) к ВО следует, однако, иметь в виду иелыи ряд агре»и»с ии и воз о хные источники ошибок. Во-первых, выеедензня из пук»с»тинной вмпнакислотная посл»до»ательность может не соответство ить реальной аслепстнне про»сесин а, который часто происходит как на уро ие информанионаои РНК, так и при преврашении белка-предшестаен. ника в конечный белок. Во-»тарих, лишь олив ошибка в определеьми ооследоаательжхти ДНК (пропуск или вставка) ори однт к выведению совершение неправильной аммиак»слети»и по«ледоввте ьности белка.
Т» им образом, уст но»лени» перви» ой структуры ВНК не »сюда может зам нить непосредственное неслед»мни» амин»кислотной последоаательност» коанруемого ею белка. В то же вре параллельное изучение первичных структур белка и ВНК чрезвычайно ыфбективно. Р . Зт. ОП» ЗЧ " * Р" н Уетаип»ЛЕНИЕ Ну ЕОтнд»ОИ ПОСЛЕдОВатЕЛЬНОСтИ ЛаЕт ВОЗМО»- ность расположить изученные пептидные фрагменты в непрерывную Р тз Р,, полнпептидную непд позволя» решать, таким образом, нанболее », вс ( Й ею»ную за»» у структурного ан»лны белю» с другой стороны.
5 ч опт»лм МОЛ36 ЕГ-ш тг Тт Тз Т, тч 50 О 5 20 304050 ВО ММН О 20 40 ммн Т Т Т Тз т двинь е по аминоьисло ой (о*лслоахтельн и и п >Шо упр щ к и у очи»им анап з ну лео нд ои последова ел ости. Параллельноеизу(ен епсрмншьшструктурбс а»ДНКбы оиспсл за»хне, частное н ри апре(еленин ам нокисло нон последовав» нос и и Г>' субьеди ( ДНК за »мой РНК.палим разы Е.сод, пп липептид ме испи к орьк спс о» из >742 и >467 амююкнслотнмх о>та х в соо штшюнм> ( В. йд Лип ин, Е Д, Сюрплов и ар., ГОВОР В »ослепи»с одь анализ первичной с рук>урь бел ов на пена«с нсследоюини иуклеотидной последи тель»ости оответстаующих сно принц( «е (ке бб.ьшие ма ш бы Перво вчвльно такие исследования вселись белков прокарнптическик орзнизмод в осж аном Е сой, гене.
ка коюрых хорошо изучена, и получение с руктур ьж ено» нс представляло большого труда По мере рхз в т я методов генной ии кенерии появилась во'>мо к ость ам»ела ь также струи урные гены белков лукарио г к. г„г Р > г гз г 6 и ФР " " ("' " . У г" г> Р> > "Р» Р .р ° сссг Пюд .Х»Р, С Р> Р> . Р Х м фц.„ ( г>9> Возможисхтн современник ме оцов генной и >кенернн открыли широкие перспектнам ддя изуче на бел»о«их систем.
кагор с с(цс ач ра казались недоступ ммн для нс. едо зтелеи вследствие их чрезвмчаино низко о «одержани . В астнос и, совсем неллино В Е Н уме удалось опрсде .н ь (труктуры ацс »паол»нового рецептора и жно но о о р во нв з н р» о о аршна рыбь Шее>гордон е>ес(пс з Сешдн» извес нм первичнь е струк урм более 2ООО бе ков, причем е е «озрастаюш я нн(уюрмацня поступает нз анализ«нуклеозндной послед хтельностн снов. Для тек, ктп стараетси более глубо о понять язык аминок даотнык последовательностей, досту пен уже о ромиыи матер зл — об>оириый ге ст. ко прмй в целом прчасташяе собой сущее тенине фрам»ею.и книги >кивни*..
что може да>ь более глубокий его впали» Весспорно, о со»вражино необколим в ( >учении связи между стр сине функцией о цель нмх прецставителен цептндно-бе новой р р дм. Но, мо>ке бм ь, он приведет иа к о кры ию более общего»белком го кодам почв лиг нам а будущем в той лн иной мер яре»сказыва ь с»одет а белков по и> первичной структур . Это уже аж о делать достатоно успешно « отношении пространс ее ной труктурм А биологи идкав р> ь7 Вряд н прирола придумала ю( нокнслотими алфавит из 20 букв случай» . Есп, ньд чем подумал и все возрастающии поток ноьмх дан к о ок ледо ате остям отнюпь н а ' и' о рил бо е оку нмм, — напротив.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
