А.Г. Глебович, А.А. Каменский - Фундаментальная и клиническая физиология (1128368), страница 88
Текст из файла (страница 88)
схема метода (б) Днэпнзнрующэя пора Размеры поры показаны применительно к гигантским нейронам моллюсков (по Костюк П Г, Крыштапь О А Механизмы эпектрн. ческон возбудимости перепоя клетки М. Наука. 1981) ГЛАВА 15. Исследован Входной уанлитель Усилитель тока зт;-4 М „>10 Гоы 100 МОМ Диаметр клетки от 10 да 20 мкм Диаметр клетки- 20 ынм Бьюгрый ионнын обмен Утечка Сс<аержимага мнкрозлектрода Рна. 1б 3. Моди<)мкацня метала внутриклеточнога диализа (ло Коыуак Р. О, Коз|та! О.А., Р<барз<олко Ч. !., <>еьвзатьку М.
Я !Ол еаггелс~п б>е леьгоыаьгатз сег) тетбгеле 197В. Лзеагоьоелае 3, 32! — 332) Э.Нсср и В).Сань<<и< (В.В>з)сл)зил). В що <кноне лежи Вринцни исщ>едоваиня клеток методом диализа с рялом тсхничггких модификаций. Ошшко уже в 108! г. Восле публикаций О. Н, Хемилз!з (О. Р. НаииИ) и соавторов зт<л л<стол лрсврзтилс я в об)33<сдостуц<<ый, <нино. ляннций ириводить любые измер<.ния из клп<ичном у)х)В<<с.
В <щстс)я1цее Время Вс<.' злск>раф1щнолОГН !<'- скис исследования мембран к.четок ироволзптя им. На .>том мстодс мы останонилкя более подробно. 1$.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ИОННЫХ ТОКОВ У ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК МЕТОДОМ РАТСН-С1 АМР Метод расс!)-с!аи)р иозноляст рс гисцицх>вать на <ыолировзнныл клетках их иотсицналы, токи илн одиночные и<>нные лзизлы иосредстном сш цизльной стекляниО<3 ии<1етки (рз<с)) .33311!с'1 к<1), НЗНОл!Нзззнн<1ей ли<3<розлсктроз<, иа имсм<цсй соирогивлгнш. от 2 до 10 МОМ в:щвисимости от гн<щ исслелусмьы клеток.
Кроме того, метод иозвозыст )хтистриронать иоииьи каналы г и:нщиравзниы О кугочкз мембраны, которь<и ия ллазматнческой мембраны клеток методом ра1ОШС!атр мож<) бытьрасиоложси иоопинисиин) лотвсрстиюиии<п<н либо вы <иней, либо внутренней с<ороиой. На риг. 15.4 наказаны микрозлснтрод и рапи-3<н1<сткз и иролгмо>н гр<цх>наны их асзн>виыс отличия. Мь! лини огмсп>м рял иолож<псльньо, момснтов ирн оримснснии зтого мсяода ио граниснин) с кл;<ссн.
чщ кил> м<яозом фикгзции 1!Отс <и<3<вяз. Во-иервых, мсп>д рагсй-с)щлр и<мни.ы<я изучзп мслкис кл<ткн без сущсспзеииого иоврсждсиня их мсмбрзи, тогда кзк лаже один микрозлс к гроз, а тем более двз, сущсств<н<ю <кнзрсждазот мембрану. Во-вторых, сопротивление утечки «микрозлсктрод мсмбранаь нс ирсвыцщгт 500 МОМ, а ири исиользонзнии метода рассй-с!алц> и, соответственно, расс й-инигтки — более 10 ГОМ, что существенно <щияст нз ка и ство регистрации.
В-третьих, мнкрозлектралы имени' гаиротивлеиие, достнга<още< 100 МОМ, з ра<СЬ-из<нет><33 от 2 до 10 ЫОМ, что <и)зволяет нс только кзчсгтвсиио репи трировать потенциалы и токи клетки, <н> и вводить в клигки без особых ироблс м лк)бьи с<>единения. )У! ы ис будем останавливаться на техничсской сторон< лктода, иогкольку <>то обязало бы нас достаточно ОО)3ы<н)е Вннмзннс удел!! !'3;)лс'>ГГ)х)<<но-<кзл<сричгз!ьной зии ц)зту)х' и кОМ1<ьк)тср3<Ому 3<РОГрзл1мнрОВзнн<О, ч ГО 51ВНО <И" ВХОДЯ' !' В ИЗШИ ЗЗДЗЧИ.
Нз рнг. 1.)..> Н<>нззщ<ы рззлнчиьн конфигурации расс)3-с!Зн>р по Отнощсинн> к кл< тке илн фрагли нту ес мсмбраны. Оин образу<отса щ<сцифичсским образом, из!к>жен3<ь<м и!оке. (Нри из10ж<з<и>1 т< кста мы сОхрзныли а><глийску<о тсрминологин>. На нащ нз>.>ыд, это оиравдзиио, так как ш рещ>л < оотнстгтнуннцих и рминов слишком гр<жшздок.
Кроме того, все иоследши п>лы такая тсрминолопы широко исиользустся в спечсствсниой научнс>й иериодической исчзчи.) Сначала пипетку иалнодят вилогиук> к мсмбрз<и' иж>лированиой клетки (рнс. 15.5, н) н гозлзк>т в ией <шбольш<х сприцательное дзвленис (рис. 155, б). зтг> ирилодит к тому. чп) лимбраиа <щотио закуиоршз;нт отверстие ишзетш! и формируе>ся вьиот><жизый коитзнт сей-зссас!)ес1, или иначе, иниетка-лимбрзиа с саиротивлсиис м утечки более 1 ГОМ (так иазь<васмый )(!Лз ьсз!). Восле нормализации,<звлсиия В и)<не<к<' конфигурация сей.зпасйсс1 близлз к фили>ло! и целой гнтузцни, носко!и ку зона мсмбраиы, захвзчсиизя ии- Риа. 15 4 Сравнение методов регистрации с ламощью обычного мнкразлектрода (а) н росси-лнлетки (б) (37,, — сопротивление мик- розлектрода и кончика авиетки) (нз Регистрация одиночных кана- лов> Пол ред Б Сакмана н Э Неера. М.
Мнр, 19В7) М 1 ' Ъ-Р ЖЕТЕ.'> РАЗДЕП Рс Общая физиология возбудимых тканен Рис 15 5 Схема различных конфигураций рагс«-с>авр [из Реги- страция одиночных каналов l Под ред Б Сакмана и Э. Неера М. Мир, 1967! веткой, с воутрсш и й стороны коитактиру<. г с внутриклеточной жидко<-гью, а с внешней стороны —. со станЛартиь<м писк. и точи ь>м раствором.
которь>м заполня>от рзы 1>-иииг>ку..-)тз к<и>фигурзция, г одной стороны, иозволяет рсгиш риршвть олшшчнь>е ноииыс каналы иол ищи'<кой, з с другой, явля< тся иромсжугочиой лля лру> их коиф>и урзцнй. О>щ позволяет изучать иа одиночном кз>шл< роль вторичных к<сссснлжеров, которые вкчк>чщотгя чср<з р<ц<иторы илазл>атичсской к«>к<б!щи ь>. Коифигур>щия сгй-зт<з<.!«й иозвол>цт сформировать лру>ук> коифнгу!вцик>, нззываемук» их!<)с-оо! рз1сЬ.
К «образовании> приводит ргзкое огрь>ванне ииигтки оз клетки (риг. !5>5, в), причем К!К>а веа! ие мсняеп я. В зтом случае из ииистке находится лищь фраг- м<>п мембраны. виуг1хш<яя сторона к<порой сл>отргп и омьию>ощий рзгтвор нсрфузиоши>й камеры, и вне. щияя контактирует с содержимым иииетки. Дзииая конфигурация >ииользуст<я Лля изучения вклада соединений цитоилззмь> в юшзльную активность. Конфи > ура<ив ссИ -зпас)ич1 иозволяст двумя путями (в завил>«кюти от задач иссл<дошпсля) «)х>рмировьпь конфшурщ<ик>, иазывзсмук> вй<-ссИ. В одном случ и для <с получения в иииетку необходимо резко и оЛномомгитио иодап нгболыщ>г о>р>и<жплыих дав. ла цис, разрываклцес мембрану и<щ ииисткой и образу>о>цс< низкоомнь>й иуть межлу виутрсиисй средой клетки и раствором в ииосткг.
При:пом в мембрз>« возникает дырка, величина кот<Их>й позволяет осуще стиляга об«<си ионов и рззл>г>ных со<линений м<>клу пипеткой и цитоилазмой (риг. 15.5, г). В другом случае иизкоомиый путь между внутрсшц и средой кл<пки и !>щ творол> в ниц< ткс форм ирустгя:в счет влияния соединений, иахолящнхся в ииигткс и вызывакицих образовали< и мембране иор, ироницасмых для ионов. ио иг лля молекул,)то исрфорьгп<щ>ый (р<т1ога!«1) ратаса.
Литиби<лнки инстатин (лук<в>гв) и зм<)н>териции-Ь (авц>йо1епси>-В) исиол ьзуют в и иигточном растворе, побы образовать сигцифнчг< юк поры на участке мембраны иод ииисткой. Оин ироиускакп чср<з ки к>брзиу м<»«>вален >.иь«катионы и зинины. Ещ< идно соединение . грал>ицилия (дези>!с<<И!>) .
помогает формировать каналы, ироинцщмыс только лчя моновалентных катионов.;)та методика иозволщ т исслеловать ионин>стоки, иринка>о>ци<. через мембрану, идентифицировать и вычленить их. 1!ример орипшальиой кривой ири рсгигтра>ши ионных п>ков от изолированного кзрлиомиоцгп а ж< лулочка мыши в конфигурации ибо!с-ссИ ирглставл< и иа рнс. 15Х> и вил< кривой синего цвета, участки к<порой маркироваиы буквои С>. Для <ч иолучсиия у ввприкуляриых карлиомиоцит<в мыи>и фи«< ирои><зи ион нцизл иа уровне-45 мВ и ироволилн сто смещение имиульсиьв< током длительностью !40 мг ло И мВ (красная кривзя).
Пз уровне фиксироищии>го потенциала -45 мВ регистрировалн отсутл в>ц токз через мсл<брану клетки «С1ы При <ъи шенин л>ембрашюго иотсициз ла ло 0 к<В реп>стрировали входящий !.. ь-ток, т.е. ток чсрсз 1-тии Са -каналов <С2<ч и л юг< поздние токи !< (>ок «СЗэ). Посл< ок<н>чш>ия илшульсз злеьтриче- 15 6.
Оригинальная кривая изменения тока через мембрану, егисгрированная ог аенгрикулярного миоцита мыши а коиценции ы«Ые-се!1 (ло Кавыл А. Кые1еха 1, >вельег9 О. 5!>а<сика!еа с«вел! >л тел!лов>аг вуосу!еа: авр>1!сае ала аллу<«воров!с а!а всгеаке и>В Иурег!горлу Сал»о«акса>аг >Эеа. 2000, 46, 409 —. 420) ГЛАВА 15. Исследования Вопросы дпя повторения Резюме ск<ио тока внош рсгистриров!(и< полное отсутствие гока через мембрану «Сй!«.
Конфи гу)щция ууЬО1с -сс П иозволщ"г сфорл<ировать лругук> ко<>фигу!хишк> оигьк1с.ои! ра(сЬ (рнг. 1б.б), д). Медлснцо«п гяпнщщц щцнтки от к.цтки за<">валяет мембрану 1юстягнвагься ло гсх нор, нека нна ие о)д<- лится сп кн-гки и ис со>вьется. !'Сверь сс внутренняя чиоть булс! к(нгщктировать с раствором В ииист3нч 3 внсицшя с омывакяцим раствором в цсрфузиоиной щ!Ки:рс. 5)31 ко<5<!и<гурации иснО.<ь;<уется для изучения вклада соединений в<к иик й с!)еды клетки в активи<к"и <3(НИН'!Н<ЛХ К;Ц<1>ЛОВ.
Именно м< годом рз(с!>.с!ашр в раегшчнь<х коифшурациях были иолу и ны осиовиь<с рсзуль<аты, соязанныс с цзуч< и Нем ионн ь<х токов, текущих через мсмбраиу целой клс < ки, и ионных токов, текущих через ноииые каналы. Выли изучеиы н классифнцн!к>вавы почти исе иониьи кан!щи и<э<бран ирак>я<чески всех клс)ок органов н ткангй >«иных органнзх<О>5.
?)тол<у вопр<>су нсювящас>ся слсдуницая <лава. !. Мгп>л фиксации оопинивла из «нитках >ззклнюзется в )он<, что мембранный шнсицизл рсгистрируг<ся микро- СК1ЕНТРОЛОМ И ИОД!Ш)('Я ИЗ УСИ>И1'П'ЛЬ ИЗИРЯ>НСН<3Я С ИО- лнявьн» .лскгроинои глсмы с обратной связьн> его мох<но д, ипельиое вреыя фикси рова гь (или ио)щср>ки вать) иа як>- бом у(юане иу и и <цх>и)скшшя пи<а и рш в > орой мокр<иле «- грод. теппжсу лпп оотщшигш также иазывагггя ооллс(вки- ппазматической мембраны клеток методом ра1сц-о!агпр "2<вес <мемым (Ьо!с!<ий ро1ин!а1) ! !Ри помо>ии гсис!мгорз ирямо у>ольных имну)ыов.иск<ричгско<о >ока нз м<мбрзис <к>длсрлонысмий иопииша Нож<в смещ < гь.<о ис«шорой иом>й величины и улсрживзть из:пом урошю тзкжс с >ижнииью .иск<ров>нгй см ми г обр:Наш гщиыо.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
