А.Г. Глебович, А.А. Каменский - Фундаментальная и клиническая физиология (1128368), страница 87
Текст из файла (страница 87)
11а чем основывается >и>зл>ож>п>сп измерения иопиых п>ков. т(ъущих через мембрю(у? 3. л!п> !акис мс>пл фикс п(ип потопи>щла и каковы с>о возлнокиости? ! 1йции уйтс схему ме(ола фпк( ацип ооп(пиища прим(" ииплыю к акопу. Как оиа рабопкт? б Кзк м(т(щпч(сю>.>ар( гнет!и!ро(ыя, !«>иный тпк> Ч>о з акое поддерживаемый >ю ! с>щиж> (1и>!(!и>К р(цсп1ги!), смещею!ый потеиииал, ток ирп !ищлсржщ!немом потенциале> Нярпсупп !(рииук> иипиогп (пки и рсз ли мбраиу и >слово ях фиксации иопицпаг ь 6. К и; и киви пжп ил( и>пфщ(пруюп и ин кривой, отражахяцси пзмеисп1ц' ионного >ока через мел>брзиу в условя ял фиксаа!и ио!сцапала? 7. ! !ирисуйп кривыг па(р(и впй и калиевой и!ниющ!мо(ти и >еорсп!ч( скй ю !н копы рукиши пот(напала лгйогвия й.
1(о(акис ин1рисвая пропилим(кть п как о1и ля и5!ется при смс!пеппи мембранного потенциала? 9. я!о такое калиевая провозимо(ть и кю( (я!а меняется при смещении мсмбраши>го по!сш1пала? 10. Расскажи >с об избирательном блокировании иатрисвых и калиевых каналов. ИССЛЕДОВАНИЯ ПЛЛЗМАТИЧЕСКОй 6 '-' ': ':: МЕМБРАНЫ КЛЕТОК МЕТОДОМ РАТСН-СЮМР У метода Фиксации потенциала появились дополнительные экспериментальные возможности после разработки метода внутриклеточного диализа и, позднее, метода ра10))-с)агпр. При использовании метода внутриклеточного диапиза кпетка помещалась в коническую пору тефлоновой перегородки перфузионной камеры, после чего со стороны узкой части конуса мембрана разрывалась.
Таким образом, одна часть камеры контактировала с внешней стороной мембраны„а другая — с внутренней. Это позволило изучать токи, протекающие через мембрану, в условиях изменения не только внекпеточного, но и внутриклеточного раствора. Модификации метода значительно упростили выполнение исследований. Подлинный расцвет исследований мембран кпеток дал метод ра(с))-01агпр, который позволил регистрировать на изолированных кпетках потенциалы, токи или одиночные ионные каналы посредством специальной стеклянной пипетки (ра(с))-пипетки), напоминающей микроэлектрод, но имеющей сопротивление от 2 до 10 МОм для разных типов клеток.
Кроме того, метод позволил регистрировать ионные каналы с изолированного кусочка мембраны, который может быть расположен по отношению к отверстию пипетки либо внешней, либо внутренней стороной. 15.1. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА ФИКСАЦИИ ПОТЕНЦИАЛА ПРИМЕНИТЕЛЬНО К КЛЕТКАМ Х(ПЯ М(Т(ВП1К'1 фНКСЗЦНИ ИОТ(НЦНЩ!З НЗ ЗКСОНЗХ, начавшая 10)имс!шться и 1990-х гг, отгй)ьи!ала и!цюкис иерсислпшы изуч( ния ионных токов, оиа бы «а адекватна голько для аксонов и исслсловщик самих клигок Гл им мет(щом изчзлось нз 20 лиг Позднее..йто время потребовалось нз то, !тобы ириши>гобить мстоа фиксации п(пеициалз к исслсцокаииям клеток. что не улшщлось в связи с тгхиичсскичи тру>п(0(.т>!ли!..'-Э) о свя:щно г тем, что только микроэлск)ролы являлись слииствсииым «за)чиком» позволявшим Ориг(клинить уирзшииощую и репктриру!ощук> аиизрзтуру к мел(бране клсп(и.
Усилия зксисримситзторов сволилищ к тому, чтобы макси мзл!Ян) !ц)п(лзнзпт!>С>1 к >п)«ОВиял! (цашога) ИОГО (к'ООл(новация чстолз фиксации и(птнцизла с исиолыювщш(м микр(пмктрол(ю иш!оср(лствсиио на к.,иткс. Для выиолиеиия экс!Примшпов из кл(ткзх,;). 1!(- ср и Х.Д.Д(ок( (!ДХС!ц Г. !1.1).1.их, 1971), люли()>и- цировав бол(ю раниюк) инск> К Франка и У!.Тауца (К Ргш!1(, 1.Таис, 1963). разработали м(тол намерения тр>инмсмбрщии>го )Ока, иротскик>щего через ограиичсниь(й учас(ок мембраны клггки. 11собхолимым у(- ЛОВПСМ ЗЛСКВЗП>ОГО ИСИОЛЬЗОВЗИИЯ М(ТОЛЗ ЯВЛЯ(ТГЯ условие иространсппниой фиксации потенциала, т.е.
рззногть потенциалов доля(из ичеть заланиук> постояниук> в(личину иа всей Плошали мембраны, через котору!о Про и каст измеряемый п>к. Ме Гол заклк>чался В с>иу(лк)пиж(. 1!з ли мбрзнс (и рвиип щитки Г ио. мощью двух щ>(лсииых в клетку микроэ>чшггролов рспю) рирустгя и фиксируется потенциал. К клсп(е Прижимается (или полсасывастся (юл лавл( нисм) лвуствольнш! Микроииистка, заполненная нормальиь!м р(итвороч, 1!олклк>чснная к исй независимая следящая гистсмз фикгируст Потенциал в объеме мсжлу кончиком л(икроиниеткп и мембран>й из пулевом уровне. 1! рсзульгзте на вь!холе сл(дящей системы образуется сигнал, ироиорциоиальный величине тока и рез участок мембраны, оц)аиичснный площадью се!сиия микропииетки.
11р(имунис)тк> описанного л!стада очсиилно: измеряетгя ток, прогсклоии!й только чсрсз тот участок мсмбрщиж лля которого ззвсломо вьшол няется и рост раисп>си нос ус >ювис фиксации пои нциала. Ислостзток мстола ззклк>чается в трудности замены наружного рас гвора в лвусп>ольиой микроиипеткс.
Тем пс менее, его ищк>льзование позволило получить ряд важных результатов. Оказалось. что ионньн' токи нервных клеток лачес'и!с!Нн> схозны (' ионными токами аксона. Исхлеяо!Ганна метолоч фиксации и(псициалз были выиолнснь! Нз изолированных клегках рз.ыичиых ткзисй. ИЗОлириВ ни(зя клстка пр(лстзиляс! ГОООЙ экнииотсициальну!о с()>ору и и( требует л(нншиительных устройств Для ОсущсстВлснпя эт010 л!с!Олз и('ПОль;>ОВ;>ли элеюгроино-излнрительиу)о схему, привет!Снилх> на рис. 19).1, и лва микро>лслтрола, вшлсиных в олпу кл(пку. Мсмбраш!ый потсишщл регист)и!ру('Гся микр(юле!пролом и !П>лается иа )силн)ель !аиряжгиия.
С иомощьк»:л(>ктрониой сх(мь! с (х>ратной Гвязьн> его можно ллитцчьш>с время фш(сировап (или иоцлгрживать) иа любом уроши иутгм иропускаиия тока через второй микроэл( ктрол, Поэтому:>тот иотси ! !иал такжг >щзь(ванна ио>ь(срживасмыл! (!и>!(!П))> ро((п((з!).
При иом(яци генератора ирямоу! ольиь!х импульсов элсктриюского тока из ли мбранс ио>т>((рл(ииаемы!! (ютенци(и м(>жнО (м(>цать ло и( к(>!000й (п)ВОП Вс!инины п ул(рживзть иа,>том уровне также г яол!Ои(ьк>:»и к()хпи!о!! схемы с обрз(ной связью. Ток, проц какиций н рсз этот участок ли>морзиы ири Поппер>ливасмом иоты(пиале 10 МОм Уонпнтепь, ннвертнрующ сигнал н подающнн его на клетку ежуточный нтепь дпя о внешним ФЕ' - РАЗДЕЛ 11. Общая физиология возбудимых тканеи Рно. 15 1 Блок-схема установки дпя исследования кпеткак (например, нервных) методом фиксации потенциала с двумя мнкроэпектродамн Токовын мнкроэпектрод акра< <нрован (по Коэ|уих Р.О Кгюша! О А., Оогоэиепхо Р А.
Са!св<п сиггеп|э <п впа!! пеигопв 1. 1иепв(>савоп о! па|ив<о евген<э. 1924 Ее<од. Х Рьузю!. 348, 83 — 93) или под влиянием ирило)кешюго напряжения, изл|ерякю от>1сльиь>м усилителем. Пзибо.тсе сущсствщшьш ис;!остаток микро:щсктродного метода исследования нервных клеток ззклк)- Чзетеи В ОГРЗИИЧ< НИИ 6ЫСПК)ЛСйегв)ИИ СИ<)СЛ<Ь) фИК. сзции иотснцизлз. Эта методика применительно к к.иткзм имела сущсствгииьи ограиичсиия, закзючзющигся н том, по изучать в.иыииг различных гослииеиий из ионные токи л|ожио бьшо только со стороны иаружиой по|и рхишпи м(мйрзиы.
Бспи у аксона аксоилззму мож<ш было выманить как зуби)ю пасту ил тк>йик $ и .шмгии и <щ иовый рщ твор, то и и видно, 3<отакук> мз>ишузяцшос к>иткзл|и продел;пь исв<мможно. В этой гнали о> ромным и<агом яиерсл было открытие в 1!)76 г. п Советском С(ехн в Пнс>итутс физио)оп<и им. Л.Л. Богомольца (Кисе) )и>л руковолсп)ом зкзлсмию) Л)1 С ССР П.
Г, Костюка метода Внутриклсто шо|о Лиализз. Этот мсп>Л иолволял <иущсствлять ПОЛНУЮ ЗЗМСИУ ВНУтРИКЛСтОЧНОй СРСЛЫ В Иьи>ЛИРОНЗИ- иых клетках. Эксисримситальиая камера иосрслствол< воли,>ти.кчи)ной и< регоролки делилась из лва отсека (рис. ! 5.21. В иере<ори !ке с иомощьк> иглы проспер. шВали коиичсск<х о>в<.р<-гие, соответшъукнцее ио размерпм илучзгмой к. И>|кс. С|с<и(и поры покрывали гиецизльиым составом, к которол<у ирш .и ивалзсь полне|и иная микр<иши<ткой к и гкз Релко< г<ыд)ши< в иижигм отсеке отрицатель<<оп> лщ)лещ<я разрывало часть мембраны, иахолящуккя с.лой сторонь|.
13<хил! обрззол(, с одной стороны исрсгор<щки излолилзсь внешняя шсть лимйраиы, з с другой внутренняя. Каждый отсек им<л звтоиомнух> сисп му оерфузии и электронно-измерите тьнук> < хсму 1Рормзчьиая;>лск<рическзя як|пои<к ть подобной (к ветки» мо< лз 1|оллсрживз>ься несколько часов.
что иолволя.и> илучзть потенциалы и гоко и рплличиь<х риты>рзх как <. висшн<й, так и с ниутрсииси стороны мембраны. )йозлнсе в этом жс он< ) игу и йы;щ рзлрзботзиз иро- ППЫ В ИЛ| ОТОВЛСИИ!3 И ЧЗП< ИКОНЗЯ Л<ИКРОИИИЕТКЗ ( ОТВ< рс П1ем 3 $) Й)и)п) 3)и3>л|гз р 1 н|$ В< В<и и ос для в<) три к>|си> ии>го лизлизз. В результате окзлывзкпся готовь)ми как от верстие <и>двелеии я клетки. так и контур |и рфу.<ии иску('ствгниого Виутрик.'и.'точ1к>го рзст1>орз: исрфулирукнций клетку изнутри раствор<юла<'и я и одно колено микроииистки.
а Выволится в лругос. Присасывание к клетке <ютществля< т<я благодаря отрицательному гидр(кт1<т>1ческому лзвлсник> в пни<"и'с по о>пн>иииик> к сред<. в которой находятся клетки. 11а рис. 15З л( монстрируется схел<а эксперимента оо л$31лизу в его новой конфигурации. <Эиисзннзя коигтрукция микроиии< тки оказалась и!<столько улойшой, что из се основе йыл разработан основной комплекс ла.>ыи>й<иих мо. лификзций метода ш<утрикл<точиого Анализа.
Оливки <юллинньш расцвет исслгловаиий мембран к>пток лзл так называемый мс)юл рз(с!3-с)$<и)р. Этот крзйис сложный в тс голы ли тол ир<>ьчожили в 19761. з Уснпнтепь фиксации потенциала о ре|упнруемым 100 мкм коэффициентом усиления Рнс. 15 2. Установка дг<я внутрнкпеточного днапнэа н фиксации потенциала, (а) Блок.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
