Презентации лекций (1125719), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Стокс, 1-й баронет. Описал правило Стокса в1852 г.Спектр испускания и спектр поглощения несовпадают, причем, как правило, максимумпоглощения приходится на меньшую длину волны,чем максимум испускания.Сдвиг между максимумами поглощения и эмиссии –сдвиг Стокса.Спектры поглощения и испускания флюорохроманезависимы. Эмиссия ненаправлена.Правило СтоксаДиаграмма ЯблонскогоЯвление флуоресценцииВремя поглощения кванта света молекулой составляет около 1015 секунды.
Диапазон энергий поглощаемых квантовопределяется структурой электронных оболочек в молекуле.Энергия поглощенного кванта света распределяется в молекуле(возбуждение), а затем новый квант света высвечивается(флуоресценция) или молекула возвращается на исходныйэнергетический уровень иным путем (релаксация). Вальтернативе возбужденная молекула может претерпетьхимическую модификацию (переход в триплетное состояние).Запаздывание высвечивания составляет порядка 10-9 секунды.Эмиссия происходит равновероятно по всем направлениям.Сдвиг средней энергии высвечиваемого кванта обусловленпотерей энергии за счет внутренних колебаний на разрешенныхэлектронных уровнях поглощающей молекулы.Наиболее яркие органические флуорохромы – вещества счередующимися двойными связями.Примеры спектровнекоторых красителейСдвиг Стокса, как правило, невелик (10-30 нм).Спектры асимметричны, их «хвосты» заходят более, чемна 100 нм.
Спектры испускания имеют «красный» хвост,спектры возбуждения – «синий» хвост.Принцип флюоресцентноймикроскопииСдвиг Стокса используется для эффективноговыделения полос возбуждающего света и светаэмиссии из общего спектра.Интенсивность эмиссии составляет не более 10-4от интенсивности возбуждающего света, а частозначительно меньше.Для эффективного наблюдения флюоресценциинеобходимо подавить возбуждающий свет,попадающий в окуляр, с коэффициентом не менее,чем 108, желательно - 1010Для разделения возбуждающего света и светафлуоресценции используется системаинтерференционных светофильтров.Разделение возбуждающегосвета и света флуоресценцииЭпиосвещение – объектив одновременно служитконденсором.
Это позволяет свести к минимуму эффектпроходящего света.Куб светофильтров позволяет подавить нежелательный свет(отраженный препаратом и рассеянный) с эффективностьюболее, чем 107 за счет последовательного применения двухфильтров – светоделительного зеркала и запирающегосветофильтра.Коэффициент запирания светоделительного зеркала – неболее, чем 102, у запирающего светофильтра – не менее 105(хорошие фильтры имеют коэффициент 106 и более)Общий вид флуоресцентногомикроскопаЭпифлуоресцентныймикроскоп, схемаКуб светофильтров - схемаПримечание Куб светофильтров изображен в своемположении на инвертированном микроскопе. Лампа иокуляр находятся за пределами схемы.Типы светофильтровПо характеру пропускания – LP (long pass), BP (band pass), SP(short pass).По расположению – под углом 90о и под углом 45о (дихроичноезеркало).По конструкции – окрашенное стекло, интерференционныефильтры (изготовленные методом тонкослойного напыления).По применению: возбуждающие светофильтры,светоделительные зеркала, запирающие светофильтры.Дихроичный светофильтрМногослойное (10-200 слоев) тонкопленочное напылениедиэлектриками с чередующимися высокими и низкимипоказателями преломления обеспечивает эффективнуюинтерференцию большей части светового потока, и создает врезультате высокую избирательность пропускания – от 0,01 %до 0,00001% за пределами выбранного диапазона.Интерференционный(дихроичный) светофильтрМногослойное (10-200 слоев) тонкопленочное напылениедиэлектриками с чередующимися высокими и низкимипоказателями преломления обеспечивает высокуюизбирательность пропускания – до 0,00001 % в диапазонешириной до 500 нм.Примеры наносимых соединений (мягкое покрытие):показатель преломления 2.2-2.3: PbCl2, TiO2, ZnSпоказатель преломления 1.3-1.4: MgF2, SiO2, Na3AlF6.Толщина каждого слоя тщательно выдерживается, слоинаносятся методом вакуумного напыления.
Точные значениятолщин слоёв определяют положение кривую пропускания.От числа слоёв зависит ширина зоны пропускания фильтра,степень подавления и ширина ненужной части спектра.Интерференционныйсветофильтр с твердымпокрытиемТ.н. твердое покрытие - напыление слоев настеклянную подложку осуществляется с помощьюионной пушки.Твердость покрытия соответствует твердости стекла.Оно не выгорает и не «стареет» во влажных условиях.«Твердые» интерференционные светофильтры внастоящее время выпускают Semrock, Chroma,OmegaFilters.Особенности дихроичныхсветофильтровХарактеристики светофильтра сильно зависят от его угла поотношению к пучку света.Стандартная характеристика BP светофильтра – серединаполосы пропускания и ширина на полувысоте пропускания(FWHM).Например, обозначение ВР530/30 означает, что середина полосыпропускания приходится на 530 нм, а 50% пропусканиеначинается с 530-30/2 = 515 нм и заканчивается на 530+30/2 = 545нм.Полный спектр пропускания, как правило, приводится впаспорте светофильтра.Светопропускание измеряется в % либо в единицах оптическойплотности (OD) – логарифмическая шкала.
Например, OD=5означает подавление света в 105 раз.Зависимость спектра от угланаклона фильтраСпектр пропусканиясветофильтраСпектр пропускания светофильтра анализируется в двухшкалах: линейной (0-100%, слева) и логарифмической (1-10-7,справа).Линейная шкала дает общую оценку пригодности светофильтра(по ширине на высоте полупропускания), логарифмическаяшкала позволяет оценить степень подавления нежелательноговозбуждающего света.Полный ход лучейи сопряженныеплоскости вфлуоресцентноммикроскопеИнвертированныйфлуоресцентный микроскопЭпиосветительКуб светофильтров примерыВозбуждающие светофильтр расположены слева,запирающий светофильтр – сверху.В правом кубе светофильтры вынуты.
Дихроичноезеркало устанавливается по диагонали куба.Куб светофильтров светопропусканиеСпектры пропусканиясветофильтров в кубе – long-passСпектр пропусканиясветофильтров в кубе – band-passПодбор светофильтровСтандартные кубики светофильтров – DAPI, FITC,TRITC/Cy-3; TexasRed, Cy-5.Подбор светофильтров определяется спектромвозбуждения и спектром эмиссии красителя.Основное условие – максимальная регистрацияэмиссии.При одновременном использовании несколькихкрасителей возникает проблема «затекания»сигналов.Основные источники света дляфлюресцентной микроскопииРтутная лампа сверхвысокого давления (мощность100 Вт) – срок службы 300 часов.Ксеноновая лампа и смешанная (ртутно-ксеноновая)лампа (мощность 75-200 Вт) – срок службы 100-300часов.Металл-галидные лампы (мощность около 100 Вт) –срок службы 1000-2000 часов.Светодиоды («монохроматический» свет) – срокслужбы не менее 20000 часовЛазеры: газовые (мощность в линии – 1-1000 мВт);твердотельные с диодной накачкой (мощность 10300 мВт) – срок службы 5000-10000 часов.Дуговая ртутная лампасверхвысокого давленияИсточник света – пары ртути в дуговом разряде.Колба – плавленный кварц.
Электроды – вольфрам.Рабочее давление – около 30 атм. Мощность – 100 Вт.Домик ртутной лампыСпектр свечения ртутной лампыСпектр свечения – квазилинейный, он расширен за счетвысокого давления паров ртути.Максимумы – 365 (10,7%), 405 (4%), 436 (12,6%), 546 (7,1%) и 579(7,9%) нм.Яркость ртутной лампы вразных областях спектраКрасительВозбуждающийфильтрДихроичноезеркалоМощность,мВт/см2DAPI365/10395 LP23,0CFP436/25455 LP79,8GFP/FITC470/40495 LP32,8YFP500/24520 LP20.0TRITC/Cy3546/12560 LP43,1Texas Red562/40595 LP153,7mCherry587/25605 LP80,9Cy5640/30660 LP9,1Эксплуатация ртутной лампыРтутная лампа сверхвысокого давления работает отисточника постоянного тока и поджигается большим током.Лампа должна располагаться вертикально, радиаторомвверх.
Дно домика лампы не может быть ближе, чемнесколько см к поверхности стола.После поджига лампа выходит на стационарный режим втечение нескольких минут. Полная стабилизация дугизанимает не менее 20 минут. Юстировка лампыпроизводится только после ее стабилизации.После выключения лампа может быть повторно включена неранее, чем через 30 минут.Время эксплуатации (НВО103W/2) – около 300 часов.Окончание эксплуатации определяется по увеличениювремени поджига и/или падению яркости более, чем на 10%.Лекция 8Флуоресцентная микроскопия:источники света, объективы,красители и их использованиеЭксплуатация ртутной лампыРтутная лампа сверхвысокого давления работает отисточника постоянного тока и поджигается большим током.Лампа должна располагаться вертикально, радиаторомвверх.
Дно домика лампы не может быть ближе, чемнесколько см к поверхности стола.После поджига лампа выходит на стационарный режим втечение нескольких минут. Полная стабилизация дугизанимает не менее 20 минут. Юстировка лампыпроизводится только после ее стабилизации.После выключения лампа может быть повторно включена неранее, чем через 30 минут.Время эксплуатации (НВО103W/2) – около 300 часов.Окончание эксплуатации определяется по увеличениювремени поджига и/или падению яркости более, чем на 10%.Сравнение ксеноновой, металлгалидной и ртутной лампРтутная лампа сверхвысокого давления имеет квазилинейныйспектр.
Значительная часть энергии выделяется вультрафиолете. Срок службы – около 300 часов.Металл-галидная лампа имеет сходный спектр, но с меньшимипровалами между линиями. Срок службы – порядка 1000часов. Стоимость в несколько раз больше.Ксеноновая лампа имеет практически равномерный спектр ввидимой области, но большая часть энергии выделяется винфракрасном свете. Срок службы – около 300 часов.Стоимость больше, чем у ртутной лампы.Относительная яркость НВО-100 и ХВО-75:в сине-зеленой области ХВО немного ярче; в желтой – НВОярче в несколько раз.Лазерные источники светаГазовые лазеры (аргоновый, гелий-неоновые, криптоновый)– полностью устарели, но продолжают использоваться вприборах, выпущенных 4-5 и более лет назад.
Основнойнедостаток – сравнительно небольшая продолжительностьжизни и необходимость периодической юстировки.Твердотельные лазеры – имеют большуюпродолжительность жизни, более компактны. Как правило,работают в импульсном режиме. Также требуют юстировки.Диодные лазеры – значительно дешевле, имеют оченьмалые размеры, продолжительность жизни не менее 10000часов, не требуют юстировки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
