Презентации лекций (1125719), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Видны только границы клеток.Диатомовые водоросли втемном полеРазрешающая способностьмикроскопа в темном полеОпределяется яркостью источника света иточностью настройки хода лучей.Минимальный диаметр частиц – 40 нм;толщина нитчатых структур – 15-20 нм(бактериальные жгутики, отдельныемикротрубочки).Фазовый контрастПринцип метода:Падающий свет проходит через кольцевую диафрагмуконденсора и его интенсивность ослабляется кольцевойпластинкой, напыленной в объективе.Изображение формируется как результат интерференция двухволновых фронтов: прямого света и света, преломленногообъектом.Для эффективной интерференции преломленный светдополнительно замедляется на ¼ длины волны.Опыты ЦерникеОпыт 1. Мелкие частицы угля дают при освещении по Келерутемное изображение – диск Эри.Опыт 2.
Если при коноскопическом освещении закрытьдиафрагму конденсора и в з.ф.п. объектива расположитьмаленький экран, закрывающий диск Эри, то изображение частицыокажется светлым диском Эри на темном фоне.Опыт 3. Если в тех же условиях заменить маленькую маску вз.ф.п. объектива на большую, но с отверстием, соответствующимдиску Эри в центре, то изображение частицы полностью исчезает.Опыт 4. Берется прозрачный образец, который не даетизображения при настройке света по Келеру и точной фокусировке.Однако он дает видимое, но малоконтрастное изображение придефокусировке.Опыт 5.
Аналогично опыту 2 в з.ф.п. объектива располагаетсямаленький непрозрачный экран. Тогда объект становится виденкак светлый диск Эри.Таким образом, прозрачный и непрозрачный объекты преломляюти рассеивают свет.Опыт 2. Если закрытьдиафрагму конденсора и вз.ф.п. объектива расположитьмаленький экран, закрывающийдиск Эри, то изображениечастицы окажется светлымдиском на темном фоне.Опыт 3. Если заменитьмаленькую маску в з.ф.п.объектива на большую, но сотверстием, котороесоответствует диску Эри вцентре, то изображение частицыполностью исчезаетОпыт 4.
Беретсяпрозрачный образец, которыйне дает изображения принастройке света по Келеру иточной фокусировке. Однакоон дает слабое изображениепри дефокусировке.Опыт 5. В з.ф.п. объективаставится маленькийнепрозрачный экран. Тогдаобъект становится виден вплоскости изображения каксветлый диск Эри.Поглощающие и фазовые объектыПоглощающий объект – виден в проходящемсвете за счет поглощения прямого света.Изменения волнового фронта, создаваемыеобъектом, несущественны для наблюдения.Фазовый объект – плохо виден в проходящемсвете (малое поглощение), однако модифицируетволновой фронт за счет преломления иотражения части света.Метод темного поля – выделение света,преломленного и рассеянного объектом(модифицированного волнового фронта).Метод фазового контраста – суперпозицияметодов светлого и темного поля.Выводы ЦерникеСвет, преломленный поглощающим объектом, отстает наполовину длины волны, и поэтому эффективно интерферируетв з.ф.п.
объектива с непреломленным светом.Свет, преломленный непоглощающим (фазовым) объектом,отстает на четверть длины волны, и их интерференциянеэффективна.Для того, чтобы интерференция прошедшего и преломленногосвета давала различия в яркости, их сдвиг должен составлятьоколо половины длины волны, а интенсивность бытьпримерно одинаковой.Для достижения этих целей используется специальная«фазовая» пластинка для объектива и кольцевая диафрагмаконденсора.В микроскопе наиболее эффективной оказывается пластинка свытравленной в ней кольцевой канавкой для прямого света.Устройство фазового контрастаСветовой фронт, преломленный объектом, дополнительносдвигается (отстает) от проходящего фронта на четвертьдлины волны.Свет, прошедший через объект без преломления, ослабляетсяв такой степени, чтобы его интенсивность примерносоответствовала интенсивности преломленного света (в 4 разаи более).Освещение препарата производится через кольцевуюдиафрагму конденсора, которая имеет апертуру,соответствующую кольцевой пластинке в объективе.Максимальная эффективность наблюдения (максимальныйконтраст) рассчитывается на использование зеленого света(546 нм).Ход лучей впозитивномфазовомконтрастеФормирование изображенияв фазовом контрастеФазовоконтрастный микроскопСтроение фазового кольцаобъективаПоглощающий слой (серебро) напыляется на поверхностьвытравленной канавки.
Глубина канавки рассчитываетсяисходя из коэффициента преломления стекла (линзыобъектива) и длины волны света – 546 нм.Комплект для фазового контрастаРевольвер конденсораФазовый телескоп и объективФазовый «телескоп» - специальный микроскоп,который вставляется в тубус вместо окуляра ифокусируется на з.ф.п.Установка света в фазовомконтрасте1. Установите полупрозрачный и достаточно тонкий препарат на столикмикроскопа и конденсор в режим светлого поля. Для наведения нафокус вам может понадобиться закрыть апертурную диафрагмуконденсора.2. Установите в микроскопе свет по Келеру. Изображение станетпрактически невидимым.3.
Выньте окуляр, и установите вместо него вспомогательныймикроскоп. Сфокусируйте вспомогательный микроскоп на заднююфокальную плоскость объектива. На светлом поле будет резко виднасерая кольцевая пластинка – фазовое кольцо объектива.4. Полностью откройте апертурную диафрагму конденсора. Установитев ход лучей в конденсоре кольцевую (фазовую) диафрагму,соответствующую выбранному объективу. Диафрагма конденсорабудет иметь вид яркого светлого кольца.5. Юстировочными винтами фазового кольца конденсора совместитедва изображения. Светлое кольцо (конденсора) должно расположитьсяполностью внутри темного кольца (объектива).
Если видимая ширинасветлого кольца равна или больше, чем ширина темного, то первуюможно несколько уменьшить, перемещая конденсор вверх или вниз.Центрировка фазового кольцаПри правильной установке фазового контраста вз.ф.п. светлое кольцо должно полностью находитьсявнутри темного кольца. Чем больше ширина темныхободков, тем выше контраст.Центрировка фазового кольцаКайма вокруг краевРеализация методафазового контрастаСдвиг волновых фронтов преобразуется в результатеих интерференции в з.ф.п.
объектива в разностьамплитуд.Ограничения:1. Эффективный контраст возникает только тогда,когда величина сдвига одного фронтаотносительно другого незначительно отличаетсяот половины длины волны.2. Темные и светлые объекты окружены каймой спротивоположной яркостью. Ширина каймызависит от разности оптического хода двухфронтов.Типы фазового контрастаПозитивный фазовый контраст + ¼ длины волны(травление).
Объекты, замедляющие свет, выглядяттемнее фона.Негативный фазовый контраст - ¼ длины волны(напыление). Объекты, замедляющие свет,выглядят светлее фона.Аноптральный или фазово-темнопольный контраст– большой диаметр запирающего кольца, малоесветопропускание.Позитивный и негативныйфазовый контрастОбъективы для фазовогоконтрастаМаркировка – Ph + цифра (номер кольца).Типы: планахроматы, флюоритовые,планапохроматы.Недостаток – немного сниженноесветопропускание (~на 5-10%).Максимальный контраст достигается прииспользовании зеленого светофильтра.Интерференционный контрастПринцип метода:Падающий свет делится на два волновых фронта.
Изображениеформируется как результат интерференция двух волновыхфронтов, прошедших через разные области поля зрения.Существует две основных системы – микроскоп ЖаминаЛебедева и система Номарского.В первом случае происходит интерференция двух фронтов,разделенных большим расстоянием (десятки микрон), то естьсравнивается свет прошедший через объект и мимо объекта.В системе Нормаского сдвиг фронтов минимален, и фактическивыявляется градиент изменения показателя преломления внутриобъекта.Разность оптического ходаХод лучей придифференциальноминтерференционном контрастеПоляризатор и анализатор повернуты под углом 45о к плоскостиразделения лучей призмами Волластона и под углом 90о друг кдругу. Это обеспечивает равную интенсивность двух волновыхфронтов и позволяет свести к минимуму прямой свет.Дифференциальныйинтерференционный контрастСдвиг волнового фронта преобразуется в разностьамплитуд в результате интерференции двух почтисовпадающих фронтов, создаваемых за счетдвулучепреломляющей системы.Прямой проходящий свет подавляется с помощьюскрещенных поляризатора и анализатора.Направление и величина сдвига одного фронтаотносительно другого регулируются настройкамимикроскопа.Фактически DIC контраст отражает градиентизменения оптической плотности внутри препарата.Интерференционный контрастКомплектующие к DICКадры с различным сдвигомКомбинированное изображение –флюоресценция и DICФазовый контраст и DIC(Nomarski)Сине-зеленая водоросль (цианобактерия)Разные виды контрастаСравнение методов фазового иинтерференционного контрастаСравнение фазовогоконтраста и DICУстановка света – проще в ФК.Возможности усиления контраста – больше вDIC.Светопропускание объективов – больше вDIC.Величина ореола (сдвига) – настраиваемая(или постоянная) в DIC и зависит от объекта вФК.Непрерывный контур – есть в ФК и нет в DIC.Сравнение различных методовЗависимость CTF от размеров в системах с усилениемконтраста нелинейная, в отличие от светлого поля.Лекция 7Явление флуоресценции.Устройство флуоресцентногомикроскопа.Источники света дляфлуоресцентной микроскопииПравило СтоксаСэр Дж.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
