Презентации лекций (1125719), страница 10

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 10)

Таким образом, максимальное число цветов длявизуального наблюдения составляет не более трех, дляинструментального (без специальных мер) – не более четырех.Поскольку большинство спектров флуоресценцииасимметричны («красный хвост»), то флуоресцентный сигнал открасителя с меньшим максимумом эмиссии «затекает» в каналболее длинноволнового красителя, но не наоборот.Для уменьшения эффекта перекрывания помимо подборасветофильтров используется процедура «компенсации», котораяпроводится на цифровых изображениях.Флуоресцентные наночастицыЧастицы из полупроводниковых материалов (например,CdSe) с ядром переменного диаметра (2-10 нм).

Ширинаспектра поглощения и длина волны эмиссии зависят отразмера ядра.Строение флуоресцентнойнаночастицыРазмер ядра и свойства оболочки определяют спектрфлюоресценции.Полимерное покрытие делает частицу нетоксичной и позволяетполучать конъюгаты.Связываемые биомолекулы – например, биотин или антитела.Спектры возбуждения иэмиссии наночастицОсновные достоинства наночастиц:Большой сдвиг СтоксаШирокий спектр возбужденияВысокая фотостабильностьСимметричные спектры флюоресценцииНедостатки:относительно большие размеры, трудности конъюгации.Сравнение квантовых точеки органических красителейОдна квантовая точка (слева) связывается с несколькими молекуламиантител, поскольку имеет большой размер.Одна молекула антитела (справа) связывается с несколькимимолекулами небольших органических красителей.Способы флуоресцентногомеченияИммунофлюоресценция – прямая и непрямаяокраска конъюгироваными антителами.Флюоресцентная гибридизация нуклеиновыхкислот in situ (FISH) – конъюгированные зонды.Прямое связывание с мишенью (красители длянуклеиновых кислот – акридиновый оранжевый,DAPI).Красители, накапливающиеся в органеллах(жирные катионы в митохондриях - Rhodamin-123).Введение флюоресцентных белков – трансфекция(eGFP, DsRed).Работа фотодиодаОбнуление – заряд – накопление – считывание – обнулениеМаксимальный заряд фотодиода – емкость ячейкиПЗС камерыПЗС – прибор с зарядовой связью(CCD – charged coupled device)Устройство ПЗС камерыФотодиодная матрицаУстройство для экспозиции, считывания и обнуленияУсилитель выходного сигналаАналого-цифровой преобразователь сигнала (АЦП)Охлаждаемая ПЗС камера: вакуумированный корпус;система охлаждения матрицы и считывающегоустройства (ячейка Пельтье + воздушное или водяноеохлаждение)Матрица ПЗС камерыЛекция 10Цифровая микроскопия:характеристики камер;установка камеры намикроскоп; эквивалентныйразмер пикселаМатрица ПЗС камерыКоличество и размер ячеекопределяют размер матрицыФотодиод имеет, как правило, квадратную форму и размер внесколько микрон (3-30 мкм).

Считывающее устройстворасполагается обычно под или над диодом.Размер матрицы определяется как произведение размера ячейки(фотодиода) на число строк и столбцов. Он может указыватьсяточно (мм*мм) или приблизительно (в долях дюйма).Основные характеристикиПЗС (КМОП)-камерыТип камеры (cooled CCD, EMCCD, sCMOS); наличие микролинз;global shutter/rolling shutterОхлаждение – нет, воздушное, водяное.

Температура матрицы –ниже комнатной на 10-15о; отрицательная (-25оС и ниже)Количество (строка х столбец) и размер ячеек (в мкм) – размеркадра (в долях дюйма или мм).Квантовый выход (в процентах) и спектр чувствительности.Максимальная емкость (заряд) ячейки – в тысячах электронов.Разрядность АЦП (системы считывания) – 8, 12,14 или 16 бит.Темновой ток (электронов на ячейку в секунду).Частота считывания – МГц (0.5-500). Может быть переменной.Шум считывания (электронов на ячейку).Спектр светочувствительностиСпектры Coolsnap (3 разныхчипа)Темновой ток и шумсчитыванияТемновой ток измеряется в количестве электронов на ячейку всекунду. Его природа – тепловое движение электронов.Величина темнового тока экспоненциально растет стемпературой и зависит от размера фотодиода.

Дляуменьшения темнового тока матрицу камеры охлаждают.Шум считывания (электронов на ячейку) есть результатотносительно быстрого «пересчета» электронов. Он зависит отконструкции матрицы и возрастает со скоростью считывания(частотой).Частота считывания камер измеряется в МГц и составляет от0.5 до 200 и более МГц. Может быть регулируемой. В этомслучае шум считывания указывается отдельно для каждойчастоты.Камеры с охлаждениемОхлаждение матрицы осуществляется с помощью ячеек Пелтье.Каждая ступень Пелтье снижает температуру на 10-15 град.Цельсия. Степень охлаждения определяется количествомпоследовательных ступеней.Минимальное охлаждение – одна ступень (темновой ток ~1-5электронов на пиксел в секунду). Стандартное охлаждение – 2-3ступени (темновой ток менее 1 электрона на пиксел в секунду,для экспозиций в несколько секунд).Матрицы глубокого охлаждения имеют много ступеней.Матрица охлаждаемой камеры всегда вакуумирована.Специальные камеры – с дополнительным жидкостнымохлаждением (до -100оС) или с охлаждением жидким азотом (длячасовых экспозиций).КМОП камеры потребляют значительно меньше энергии, чемПЗС камеры (почти в 100 раз), соответственно их охлаждениедостигается при меньшей мощности.Емкость ячейки и разрядностьАЦПМаксимальная емкость (заряд) ячейки измеряется в тысячахэлектронов.

Она пропорциональна площади фотодиода исоставляет на практике от 20000 (размер 4,5 мкм) до 350000(размер 16 мкм).Камеры «научной» градации имеют емкость фотодиодов не менее40000 электронов (размер более 6 мкм).Разрядность АЦП (системы считывания) составляет 8, 12, 14 или16 бит, что соответствует числу уровней серого 28 = 256; 212 = 4096;214 = 16384; 216 = 65536. Разрядность записи числа уровней серого вкомпьютере составляет 8 или 16 бит.Монохромные камеры «научной» градации имеют разрядностьАЦП не менее 12 бит. При этом запись изображения в компьютерепроизводится с разрядностью 16 бит, однако «верхние» уровнияркости оказываются незаполненными.Основные производителипрофессиональных камер длямикроскопииAndor – iXON series (12-16 bit, QE 50-90%), EMCCD;CMOS – Zyla 4.2, Neo (16 bit, QE 60-72%).Hamamatsu Photonics – ORCA-II (1024x1024, 13 um, 1416 bit, QE~80%); CMOS ORCA Flash 4.0 (16 bit, QE~60%).Photometrics – Cascade-II (512x512, 16 um, 16 bit,QE>90%), EMCCD; Coolsnap HQ-2 (1392x1040, 6,45 um,14 bit, QE>60%)Производители микроскопов (Карл Цейсс, Лейка,Никон, Олимпус) также выпускают ПЗС камеры длямикроскопов, но они значительно уступают лидерампо своим характеристикам.Инвертированныйфлуоресцентный микроскопУстановка камеры на микроскопПрямой микроскоп – тринокулярный тубус сосветоделителем (фотоокуляр).

Для установки камерыиспользуется специальная оптика (фотоокуляр).Инвертированный микроскоп – боковой порт сосветоделителем или зеркалом (линза); нижний порт.Для установки камеры в микроскопе изготовителемустанавливается линза. Дополнительная оптика нужна,только если необходимо изменять масштабизображения, проецируемого на матрицу камеры(растягивать или сжимать).Стандартное присоединение камеры – С-mount (резьбадиаметром 25 мм или 1 дюйм).Установка камеры намикроскопПростейшее решение – вместо окуляра или с использованиемсуществующего окуляра.Оно не является наилучшим – теряется много света и качествоизображения не оптимально.Адапторы для камерыПростейший адаптор для камеры – c-mount, регулируемая длина. Даетувеличение х1 (на специальном выходе инвертированногомикроскопа).Внутри адаптора может располагаться окуляр (на прямоммикроскопе).Более сложный адаптор имеет встроенную линзу длямасштабирования – от 0,3 до 2,5Условие парфокальностиПравильная установка камеры предполагает, чтоизображение фокусируется на матрице при том жеположении столика, когда оно резко изображается вокулярах (условие парфокальности).Независимая подстройка окуляров по внутреннеймаске – возможна только в некоторых микроскопах.В основном – парфокальность камеры проверяется впроцессе установки света по Келеру.

Она достигаетсяперемещением камеры относительно тубусамикроскопа.Поскольку глубина резкости в пространствеизображений минимальная при малых увеличениях,настройка парфокальности проверяется в объективомх10 или меньше (желательно – х2,5-х4).Установка промежуточнойлинзыВсе линзы для установки перед камерами являются сложными.Они монтируются в адаптер и обеспечивают «перенос зрачка»,то есть скорректированы на создание безаберрационногоизображения на матрице камеры.Для камер с ячейкой более 8 мкм применяются растягивающиелинзы Рэлея с коэффициентами х1,5; х2,0 х2,5.Для камер с ячейкой менее 5 мкм допустимо использованиесжимающих линз с увеличением х0,63 - х0,5, однако этоприводит к потере разрешения при использованиивысокоапертурных объективов с небольшим увеличением(например, х40/1,3; х20/0,75).Непрерывное и дискретноеизображениеДифракционное ограничение разрешения оптического приборапредполагает визуальное наблюдение, то есть сканированиеполя зрения с исчезающе малым шагом.При записи на матрицу изображение подвергается пикселизации– разделению на участки (как правило, квадраты) внутри которыхинформация утрачивается (яркость интегрируется).Пикселизация создает дополнительное ограничение разрешенияприбора.При достаточно малых размерах пиксела записанноеизображение является хорошим приближением оригинала, тоесть контраст его мало отличается от исходного, а за счет болееширокого динамического диапазона камеры может быть дажеувеличен по сравнению с визуальным.Увеличение и разрешениевидеомикроскопической системыУвеличение – масштаб изображения на экране.Объектив х100 дает увеличение на мониторе сдиагональю 20’ около х3000-х6000.Разрешение записанного изображения всегда хуже,чем при визуальном наблюдении.Разрешение системы примерно равно удвоенномуэквивалентному размеру пиксела, если этот размерсоставляет не менее 1/2 диска Эри.При эквивалентном размере пиксела менее 1/3 дискаЭри (расчетного разрешения объектива микроскопа)суммарное разрешение определяется в основномапертурой объектива.Пространственное разрешениев видеомикроскопииЭквивалентный размерпикселаЭквивалентный размер пиксела – размер пикселакамеры при проекции его в пространство предметов.Эквивалентный размер пиксела равен физическомуразмеру пиксела, деленному на общее увеличение наматрице камеры.Для микроскопов, скорректированных набесконечность и имеющих специальныфй порт длякамеры, общее увеличение определяется объективом,системой переноса зрачка и проекционной линзой,устанавливаемой перед камерой.

Характеристики

Список файлов лекций