Презентации лекций (1125719), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Волновой фронт не вполнекогерентен. Работают в непрерывном режиме.Твердотельные лазеры с диодной накачкой.Для присоединения лазера к обычному микроскопутребуются специальные устройства (scrambler), полностьюразрушающие когерентность волнового фронта.Примеры твердотельныхлазеровТвердотельный лазер сдиодной накачкой (DPSS)Конструкция лазера зависит от длины волны. Общий принцип –накачка твердотельного резонатора с помощью светодиода.На выходе из резонатора – коллиматор пучка и ИК фильтр.Лазерная указкаДиапазон мощностей – 1-1000 мВт.
Для микроскопии – 50-200 мВт.Основные длины волн: 365 нм; 405 нм; (445 нм; 473 нм); 488 нм;532 нм; 561 нм; 594 нм; 635-640 нм.СветодиодыСравнительно новые источники освещения (в микроскопииприменяются с 2006 года).Светодиод излучает в ширине около 30-40 нм, мощность –порядка 10-200 мВт.Осветители в виде комплектов светодиодов выпускаютсянесколькими фирмами.Яркость освещения – несколько ниже, чем у ртутной лампы, нобольше, чем у галогеновой лампы.Преимущества: регулируемая мощность, высокаястабильность, быстрое переключение длин волн; длительныйсрок службы (не менее 20000 часов).Сравнительная характеристикаисточников светаОбъективы дляфлюоресцентного микроскопаТипы объективов: Plan; PlanFluor; SuperFluor;Planapo; TIRF objectives (NA>1,45)Требования:1.
Большая светособирающая сила объектива (CCO).ССО измеряется как отношение числовой апертуры (NA) кувеличению.Яркость изображения при флуоресцентной микроскопиипропорциональна четвертой степени числовой апертуры.Таким образом, использование при одинаковом увеличенииобъектива c NA= 0,75 по сравнению с NA=0,65 увеличиваетяркость изображения почти в два (в 1,77) раза; увеличениеапертуры с 0,85 до 1,2 дает выигрыш в 4 раза.Максимальная ССО – у объективов х20/0,75, х40/1,3.Объективы дляфлюоресцентного микроскопаВысокое светопропускание объектива в коротковолновойчасти спектра (λ<430 нм) необходимо для работы скрасителями, возбуждающимися в ближнем УФ свете(например, DAPI, красители для определения кальция –Fura2, Indo и др.).Этому условию плохо удовлетворяют планапохроматы,поэтому наибольшее распространение получилипланфлуоритовые объективы.При использовании нескольких красителей с далекоотстоящими друг от друга спектрами необходимость свести кминимуму аберрации привела к разработке специальных«суперапохроматов» - объективов, для которых аберрацииисправлены во всем диапазоне видимого спектра (400-750нм) и ближнем ИК спектре.Сочетание красителей ифильтровСветофильтры выделяют для наблюдения небольшую частьспектров возбуждения и эмиссии.Правильный подбор селективных светофильтров можетуменьшить эффект «затекания» сигнала.Флуоресцентные красителиКрасители для нуклеиновых кислот (РНК, ДНК).Мембранные красители органелл (митохондрий, АГ,лизосом и др.).Для конъюгирования с антителами, нуклеотидами идр.Сенсоры (рН, окислительно-восстановительныйпотенциал, ионы кальция, ионы натрия)Флуоресцентные белки животного происхождения.Тандемные красители для исследованияфёрстеровского переноса энергии (FRET).Основные характеристикифлуоресцентных красителейКоэффициент экстинкции – ε (20000-200000 М-1см-1)Квантовый выход – Qe (20-90%).
Флуоресцеин – 92%.Среднее время высвечивания флуоресценции – τ (0,5-20 нс).Флуоресцеин – 4,5 нс.Стабильность – величина, обратная вероятности фотодеструкции(отношение Qe/Qd). Флуоресцеин: Qe/Qd = 3х104.Спектры поглощения и испускания – максимумы, ширина наполувысоте (FWHM), сдвиг Стокса (флуоресцеин и ФИТЦ – 24 нм;GFP – около 20 нм).Все спектры эмиссии органических красителей широкие.
Поэтомупри совместном использовании нескольких красителей возникаетэффект перекрывания сигналов. Сигнал от красителя с меньшиммаксимумом эмиссии «затекает» в канал более длинноволновогокрасителя.Характеристики некоторыхфлюорохромовСтабильностьфлуоресцентных красителейПримеры часто употребляемыхфлюоресцентных красителейЦианиновые красителиКрасители достаточно стабильны, но имеютнебольшой сдвиг Стокса.Красители семействаAlexaFluorНаиболее стабильные из органических красителей(Alexa488, Alexa 555, Alexa 568, Alexa 647). Имеютнебольшой сдвиг Стокса и различный коэффициентэкстинкции.Флуоресцентные белкиНеобходимые характеристики:- спектры возбуждения и эмиссии- время и эффективность созревания (folding)- коэффициент экстинкции и квантовый выход- фотостабильность (для пролонгированных экспериментов)- изоэлектрическая точкаGFP и его мутанты:Yellow FP, EYFP (514/527 nm)Green FP, EGFP (488/509 nm)Cyan FP, ECFP (475 nm)Blue FP, EBFP (448 nm)Красные флюоресцентные белки (возбуждение – 550-590 нм,флюоресценция 580-640 нм) – очень много, но они менеестабильны, чем производные GFP.Зеленый флуоресцентныйбелокНобелевская премия,2008Осама Симомура, МартинЧалфи и Роджер Тсьен.Выделен из медузы Aequoreavictoria, экспрессирован впро- и эукариотах.
Полученомножество мутантов.Исходный белок – 238 а-к,мол. вес 26,9 кД.Флуорофор находится вцентре складчатой структуры.Флуоресцентные белкикоралловMatz et al., 1999Характеристики некоторыхфлуоресцентных белковСпектры некоторыхфлуоресцентных белков(Evrogen)Специальныефлуоресцентные красителиМерцающие красители: спонтанно переходят изфлуоресцентного в нефлуоресцентное состояние иобратно.Фотоактивируемые красители (caged dyes) – подвоздействием коротковолнового света переходят вофлуоресцентное состояние.
Некоторыефотоактивируемые красители могут возвращатьсяво флуоресцентное состояние многократно.Спектр пропускания светофильтров вкубе – двойной набор (double set)Перекрывание сигналовПри одновременном использовании нескольких флуорофоровосновная проблема состоит в перекрывании сигналов. Величинаперекрывания зависит от спектров красителей и применяемыхсветофильтров.Конфигурации наборовсветофильтровМногоцветный куб позволяет получить цветное изображение.Набор Пинкеля (Pinkel set) требует одного колеса с фильтрами и двухмногополосных фильтров – светоделителя и запирающего фильтра.Набор Седата (Sedat set) требует двух колес с фильтрами. Колесо сзапирающими светофильтрами устанавливается перед камерой.Варианты комплектациисветофильтровПодбор светофильтров длякрасителяОпределение спектра возбуждения и испускания красителя –максимумы, ширина, асимметрия.Максимальная яркость – детектирование отдельных молекули другие случаи слабых сигналов.
Используется широкаяполоса пропускания запирающего фильтра и LP запирающийфильтр. Такой подход неудобен для одновременногоиспользование нескольких красителей. Также он приводит котносительному возрастанию автофлуоресценции.Для максимальной селективности (при достаточной яркостисигнала) используется узкая полоса пропусканиявозбуждающего и запирающего фильтров, которыемаксимально соответствуют пикам поглощения и эмиссиикрасителя. Это позволяет уменьшить автофлуоресценцию(которая всегда имеет широкий спектр) и добиться большейселективности при работе с несколькими флуорохромами.Способы флуоресцентногомеченияИммунофлюоресценция – прямая и непрямаяокраска конъюгироваными антителами.Флюоресцентная гибридизация нуклеиновыхкислот in situ (FISH) – конъюгированные зонды.Прямое связывание с мишенью (красители длянуклеиновых кислот – акридиновый оранжевый,DAPI).Красители, накапливающиеся в органеллах(жирные катионы в митохондриях - Rhodamin-123).Введение флюоресцентных белков – трансфекция(eGFP, DsRed).Флуоресцентные красителидля визуальных наблюденийФлуоресценция в диапазоне 450-630 нм.Возбуждение – УФ, синий свет (450-490 нм),зеленый свет (500-550 нм).Малое время высвечивания флуоресценции(большая яркость).Флюоресцентные красителидля инструментальныхнаблюденийФлюоресценция в диапазоне 400-850 нм.Возбуждение – УФ (340-395 нм), фиолетовый свет(407 нм); синий свет (450-490 нм), зеленый свет(500-550 нм), желто-красный свет (570-640 нм),ближний ИК свет (730-780 нм).Высокая фотостабильность, большой квантовыйвыход.Автофлуоресценция живыхклетокАвтофлуоресценция аминокислот – тирозин, триптофан,фенилаланин.
Белки – коллаген, эластин.Автофлуоресценция возбуждается в диапазоне 270-490 нм. Онапрактически отсутствует при возбуждении светом >500 нм.Эмиссия – синий свет (слабая), зеленый свет (средняя-сильная),желто-оранжевый свет (сильная).Автофлуоресценция клеток – в видимой области светят НАД-Н,рибофлавин, ретинол, липофусцин, меланин. Основныеорганеллы – предположительно лизосомы (не митохондрии!).Относительно яркой автофлуоресценцией обладают макрофаги,нейроны, мышцы, сперматозоиды.Автофлуоресценцияфиксированных клетокАвтофлуоресценция клеток может возрастать прификсации (особенно сильно – при альдегидной).Для ее уменьшения можно использоватьборогидрид натрия (свежеприготовленныйраствор в ФФБ), или избегать альдегидов всоставе фиксатора (метанол, ацетон при низкойтемпературе и др.).Чтобы уменьшить влияние автофлуоресценции,целесообразно пользоваться длинноволновымикрасителями (эмиссия свыше 580 нм).АвтофлюоресценциямиокардиоцитовАвтофлуоресценция доказывается широким спектромсвечения и отсутствием специфических окрашенныхструктур.Флуоресценция иавтофлуоресценция в клеткахрастенийЗеленый цвет – GFP-актин (трансфекция); красный –автофлуоресценция хлоропластовПрижизненные наблюденияПоддержание постоянной температуры - инкубатор.При использовании иммерсионного объективаобязательно его термостатирование.Поддержание баланса рН – добавление HEPES (10-25мМ) в среду с минимальным содержаниембикарбоната или подача СО2 в специальной камере,или использование специальных культуральных сред(СО2-независимых)Уменьшение фотодеструкции – синхронизированныйс камерой затвор; снижение парциального давлениякислорода (оксираза).Уменьшение автофлуоресценции – использованиеспециальных культуральных сред (без витаминов идр.
добавок).Вещества, защищающиефлуорохромы от выцветанияВеществоКомментарииНаиболее эффективен для FITC. Также работает дляp-phenylenediamineRhodamine. Применяется в концентрации 0.1% вглицерине/PBS. Хранить в темноте, быстро разрушается насвету. Очень токсичен для кожи.DABCO(1,4-diazabi-Высокоэффективен для FITC. Несколько уступает p-cyclo-2,2,2-phenylenediamine, но более устойчив к свету и менее токсичен.octane)n-propylgallate2-mercaptoethylamineНаиболее эффективен для Rhodamine, Также работает дляFITC.
Применяется в концентрации 1% в глицерине /PBS.Для окраски хромосом и ДНК с помощью propidium iodide,acridine orange, или Chromomysin A3. Применяется вконцентрации 0.1mM 2-mercaptotheylamine в Tris-EDTAСовместное использованиенескольких красителейВсе спектры флуоресценции органических красителей широкие.Поэтому при совместном использовании более двух красителей,как правило, возникает эффект перекрывания сигналов.При подборе красителей необходимо, чтобы расстояние междумаксимумами их эмиссий было не менее 40-50 нм. Желательно –60 и более нм.
Таким образом, максимальное число цветов длявизуального наблюдения составляет не более трех, дляинструментального (без специальных мер) – не более четырех.Поскольку большинство спектров флуоресценцииасимметричны («красный хвост»), то флуоресцентный сигнал открасителя с меньшим максимумом эмиссии «затекает» в каналболее длинноволнового красителя, но не наоборот.Для уменьшения эффекта перекрывания помимо подборасветофильтров используется процедура «компенсации», котораяпроводится на цифровых изображениях.Квантовый выход ирегистрация флуоресценцииКвантовый выход (Qe) рассчитывается как вероятностьизлучательного перехода.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
