Презентации лекций (1125719), страница 5

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 5)

Фокусировка лампы и центрировка осветителя.2. Фокусировка полевой диафрагмы.3. Центрировка диафрагмы конденсора с помощьювспомогательного микроскопа.4. Окончательная настройка осветителя.5. Согласование полевой и апертурной диафрагм сиспользуемым объективом.6. Максимальное разделение по оси z двух группсопряженных плоскостей.Необходимые элементы дляустановки света по КелеруВ микроскопе должны быть:• Регулируемая полевая диафрагма(осветителя)• Регулируемая и центрируемая апертурнаядиафрагма (конденсора)• Перемещающийся в трех плоскостяхконденсорПоследовательные шаги:1) Полностью открыть полевую иапертурную диафрагмы, увидетьпрепарат2) Сфокусироваться на препарат•Закрыть полевую диафрагму•Сфокусировать изображениедиафрагмы перемещая конденсорвверх-вниз•Центрировать полевую диафрагму,затем открыть ее до освещенияполя зрения•Вставить вспомогательныймикроскоп•Закрыть апертурную диафрагму до4/5 апертуры объектива1) Открыть полевую и апертурнуюдиафрагмы2) Сфокусировать препарат3) Закрыть полевую диафрагму•Сфокусировать изображениедиафрагмы перемещаяконденсор вверх-вниз•Центрировать полевуюдиафрагму, затем открыть ее доосвещения поля зрения•Вставить вспомогательныймикроскоп•Закрыть апертурную диафрагмудо 4/5 апертуры объектива1) Открыть полевую и апертурнуюдиафрагмы2) Сфокусировать препарат3) Закрыть полевую диафрагму4) Сфокусировать изображениедиафрагмы, перемещая конденсорвверх-вниз•Центрировать полевую диафрагму,затем открыть ее до освещенияполя зрения•Вставить вспомогательныймикроскоп•Закрыть апертурную диафрагмудо 4/5 апертуры объектива1) Открыть полевую и апертурнуюдиафрагмы2) Сфокусировать препарат3)Закрыть полевую диафрагму4) Сфокусировать изображениедиафрагмы перемещая конденсорвверх-вниз5) Центрировать полевую диафрагму•затем открыть ее до освещенияполя зрения•Вставить вспомогательныймикроскоп•Закрыть апертурную диафрагму до4/5 апертуры объектива1) Открыть полевую и апертурнуюдиафрагмы2) Сфокусировать препарат3)Закрыть полевую диафрагму4) Сфокусировать изображениедиафрагмы перемещая конденсорвверх-вниз5) Центрировать полевую диафрагму6) Открыть ее до освещения поля зрения•Вставить вспомогательный микроскоп•Закрыть апертурную диафрагму до 4/5апертуры объектива1) Открыть полевую и апертурную диафрагмы2) Сфокусировать препарат3) Закрыть полевую диафрагму4) Сфокусировать изображение диафрагмыперемещая конденсор вверх-вниз5)Центрировать полевую диафрагму6)Открыть ее до освещения поля зрения7)Вставить вспомогательный микроскоп8)Закрыть апертурную диафрагму до 4/5апертуры объективаПримечание: для малоконтрастногопрепарата закройте диафрагмуконденсора до ~ 30% NAобъективаЗФП1)2)Открыть полевую и апертурную диафрагмыСфокусировать препарат3)Закрыть полевую диафрагму4) Сфокусировать изображение диафрагмыперемещая конденсор вверх-вниз5) Центрировать полевую диафрагму6) Открыть ее до освещения поля зрения7) Вставить вспомогательный микроскоп8) Закрыть апертурную диафрагму до 4/5 апертурыобъектива9) Вынуть вспомогательный микроскоп и вставитьокулярГотово!Преимущества установкисвета по Келеру1.

Гомогенное освещение поля зрения.2. Численная апертура конденсора и величинаосвещенного поля на столике микроскопа могутрегулироваться независимо друг от друга.3. Плоскость переднего фокуса конденсорапередается в заднюю фокальную плоскостьобъектива. Это создает минимум рассеянногосвета в оптическом пути микроскопа иоптимальные условия для усиления контрастаизображения.4.

Достигается максимальное латеральное (x-y) иосевое (z) разрешение микроскопа.Основные ошибки приустановке света1. После установки света конденсор опускался.2. При смене объектива не перестраивалисьполевая и апертурная диафрагмы.3. В ход лучей вместо нейтральных светофильтровввели матовое стекло.4. Изображение диафрагмы конденсора имеетнеравномерную кайму.Все отклонения в настройке света приводятк снижению контраста изображения!Объемное изображение точки видеальной оптической системеИзображение точки есть искажение волнового фронтав плоскости изображения.PSF (point spread function) – функция рассеяния точки(ФРТ).Изображение точки в плоскости передается дискомЭри, параметры которого определяются свойствамилинзы (объектива). Для свободной от аберрацийоптической системы размер диска Эри определяетсятолько ее апертурой.Изображение точки вдоль оси микроскопаописывается эллиптической перетяжкой.Объемноеизображение точки(функция рассеянияточки – PSF)в идеальнойоптической системеПроекции объемного изображения точки (ФРТ)в поперечной и меридиональной плоскостяхХарактеристика перетяжкиFWHM – full width at halfmaximum (ширина наполувысоте).FWHM являетсяколичественной мерой дляописания различныхоптических картин.Данная характеристикаявляется исчерпывающей,только если известнафункция на графике.Понятие оптического срезаОптический срез – плоскость в пространствепредметов, изображение которой создает микроскоп взависимости от своей настройки в пространствеизображений.Наилучшее изображение оптического срезаполучается при попадании препарата в переднююапланатическую точку объектива.При визуальном наблюдении отдельный оптическийсрез трудно различим из-за аккомодации глаза.Окрестности оптического среза (выше- инижележащие плоскости) размываются микроскопом,и степень этого размытия определяет толщину(глубину) так называемого «резко изображаемогопространства».Оптические срезыОптический срез – часть препарата, изображение деталей вкоторой размыто в пределах половины диска Эри.

Его толщинадля иммерсионных объективов составляет менее 1 мкм.Разрешающаяспособность по оси zРасстояние от центра до первого дифракционногоминимума по оси z рассчитывается по формуле:z = 2λn/(NA)2,где λ - длина волны света, n – коэффициентпреломления среды, и NA – числовая апертураобъектива.Соотношение аксиального и радиального разрешения(по критерию Рэлея) составляет:z/r = 3.28*n/NAГлубина поля зренияГлубина резкого поля зрения – область пространства,расположенная выше и ниже плоскости фокусировкиобъектива, где расфокусировка изображения точки непревышает половины радиуса диска Эри (или кружканерезкости).Максимально допустимая величина расфокусировкипри микрофотографии приближенно определяется какодна четверть расстояния до дифракционногоминимума по оси z.За счет аккомодации глаза глубина поля зрения привизуальном наблюдении увеличивается.Толщина резко изображаемойобласти предметаМаксимально допустимая величина расфокусировкиприближенно определяется как:dилиλ - длина волны света, n – коэффициент преломлениясреды, и NA – числовая апертура объектива.где«Оптический срез» – слой резко изображаемого пространства.Под «толщиной оптического среза» подразумевается слой,центр которого находится в фокусе (реальный оптическийсрез), а толщина равна удвоенной величине допустимойрасфокусировки.Глубина изображенияГлубина изображения – область пространства,расположенная выше и ниже плоскостифокусировки, где расфокусировка изображения непревышает допустимого кружка нерезкости.Допустимый размер кружка нерезкостиопределяется детектором (глаз, камера).Глубина поля зрения и глубина изображениясвязаны обратной нелинейной зависимостью.Максимальная глубина изображения достигаетсяпри использовании иммерсионного объектива,минимальная – с объективом малого увеличения.Глубина поля зрения и резкогоизображенияУвеличениеАпертура(NA)Глубина полязрения (мкм)Глубинаизображения (мм)4x0.127.20.1310x0.206.80.820x0.41.73.840x0.650.6512.860x0.950.3029.8100x1.4 (имм.)0.2180Типы оптических системЕсли аберрации в пределах поля зрения малы (существенноменьше λ/4), то система называется дифракционноограниченной (объектив микроскопа, зеркало телескопа).Но малые аберрации существуют только дляапланатических точек, вне их изображения размываются.Если аберрации велики, система называется геометрическиограниченной (объективы фотоаппаратов и проч.).

Длягеометрически ограниченной системы формированиеизображения хорошо описывается с помощьюгеометрической оптики. Изображения объемных предметовимеют практически одинаковое качество по всему полю.В геометрически-ограниченной системе уменьшение апертуры(закрытие диафрагмы) в определенных пределах улучшаеткачество изображения (уменьшается кружок нерезкости), а вдифракционно-ограниченной системе – ухудшает всегда(размывается диск Эри).Функция передачи контрастав оптической системеСтепень контрастности изображения (отношение контрастапредмета в контрасту его изображения) быстро убывает с ростомпространственной частотыЛекция 6.Методы усиления контраста вмикроскопии: темное поле,фазовый контраст,интерференционный контрастМетоды усиленияконтраста в проходящемсвете – визуализациянеокрашенных препаратовМетод темного поляПринцип метода – в объектив попадаеттолько свет, преломленный илирассеянный объектом (Зидентопф, 1907,1909).Для получения яркого и контрастногоизображения используется объектив срегулируемой апертурой и специальныйвысокоапертурный конденсор.Ограничение метода: часто видны тольконаружные границы объекта, а внутренняяструктура может не разрешаться.Освещение в темном полеМалое увеличение – сухой конденсор сцентральным экраном и диафрагмойБольшое увеличение (иммерсия) –иммерсионный кардиоидный конденсор спостоянной апертурой, иммерсионныйобъектив с апертурной диафрагмойДля живых объектов максимальнаяапертура конденсора – 1, 336.Кардиоидный конденсорКардиоидный конденсор создает полый конус света, внутренийугол которого немного превышает апертуру объектива.Ход лучей в темном полеТемнопольные изображенияА-С – хламидомонады; D – буккальный эпителийА – светлое поле, конденсор опущен; B – светлое поле,освещение по Келеру; С, D – темное полеБактерия в темном полеБактерия среди эритроцитов.

Характеристики

Список файлов лекций