Презентации лекций (1125719), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Он всегда меньше единицы, номожет приближаться к ней. Квантовый выход флуоресцеина(в пике) – 92%.При смещении полосы возбуждения от пика квантовый выходснижается.Эффективность детектирования флуоресценции зависит отквантового выхода (возбуждение) и от полосы пропусканиязапирающего фильтра.Для оценки эффективности регистрации флуоресценции длябольшинства красителей используются специальныепрограммы – например, Spectra viewer.Спектры некоторых красителей могут изменяться при ихвзаимодействии с клеткой (как правило – сдвиг в болеедлинноволновую сторону и расширение спектра эмиссии).Подбор красителей ифильтров – Spectra viewerИнтерактивная система, позволяющая посмотреть спектрывыбранных красителей и оценить их совместимость.Наблюдение отдельной молекулыво флуоресцентной микроскопииФлуорохром – максимально стабильный(Qe/Qd>105).Объектив с максимальной светособирающейсилой (например, х60/1,45) .Квантовый выход камеры – не менее 70%;эквивалентный размер пиксела 0,1-0,15 мкм.Критерий: свечение не затухает постепенно, нопропадает внезапно и полностью.Флуоресцентные наночастицыЧастицы из полупроводниковых материалов (например,CdSe) с ядром переменного диаметра (2-10 нм).
Ширинаспектра поглощения и длина волны эмиссии зависят отразмера ядра.Строение флуоресцентнойнаночастицыРазмер ядра и свойства оболочки определяют спектрфлюоресценции.Полимерное покрытие делает частицу нетоксичной и позволяетполучать конъюгаты.Связываемые биомолекулы – например, биотин или антитела.Спектры возбуждения иэмиссии наночастицОсновные достоинства наночастиц:Большой сдвиг СтоксаШирокий спектр возбужденияВысокая фотостабильностьСимметричные спектры флюоресценцииНедостатки:относительно большие размеры, трудности конъюгации.Сравнение квантовых точеки органических красителейОдна квантовая точка (слева) связывается с несколькими молекуламиантител, поскольку имеет большой размер.Одна молекула антитела (справа) связывается с несколькимимолекулами небольших органических красителей.Лекция 9Флуоресцентная микроскопия:наблюдение несколькихкрасителей; работа с живымиклеткамиСпектр пропускания светофильтров вкубе – двойной набор (double set)Конфигурации наборовсветофильтровТолько многоцветный куб позволяет получить цветное изображение.Набор Пинкеля (Pinkel set) требует одного колеса с фильтрами и двухмногополосных фильтров – светоделителя и запирающего фильтра.Набор Седата (Sedat set) требует двух колес с фильтрами и одногомногополосного светоделителя.
Второе колесо (с запирающимисветофильтрами) устанавливается перед камерой.Варианты комплектациисветофильтровПодбор светофильтров длякрасителяОпределение спектра возбуждения и испускания красителя –максимумы, ширина, асимметрия.Максимальная яркость – детектирование отдельных молекули другие случаи слабых сигналов. Используется широкаяполоса пропускания запирающего фильтра и LP запирающийфильтр. Такой подход неудобен для одновременногоиспользование нескольких красителей.
Также он приводит котносительному возрастанию автофлуоресценции.Для максимальной селективности (при достаточной яркостисигнала) используется узкая полоса пропусканиявозбуждающего и запирающего фильтров, которыемаксимально соответствуют пикам поглощения и эмиссиикрасителя. Это позволяет уменьшить автофлуоресценцию(которая всегда имеет широкий спектр) и добиться большейселективности при работе с несколькими флуорохромами.Подбор красителей ифильтров – Spectra viewerИнтерактивная система, позволяющая просмотреть спектрывыбранных красителей и оценить их совместимость.Квантовый выход ирегистрация флуоресценцииКвантовый выход (Qe) рассчитывается как вероятностьизлучательного перехода.
Он всегда меньше единицы, номожет приближаться к ней. Квантовый выход флуоресцеина(в пике) – 92%.При смещении полосы возбуждения от пика квантовый выходснижается.Эффективность детектирования флуоресценции зависит отквантового выхода (возбуждение) и от полосы пропусканиязапирающего фильтра.Для оценки эффективности регистрации флуоресценции длябольшинства красителей используются специальныепрограммы – например, Spectra viewer.Спектры некоторых красителей могут изменяться при ихвзаимодействии с клеткой (как правило – сдвиг в болеедлинноволновую сторону и расширение спектра эмиссии).Перекрывание сигналовПри одновременном использовании нескольких флуорофоровосновная проблема состоит в перекрывании сигналов.
Величинаперекрывания зависит от спектров красителей и применяемыхзапирающих светофильтров.Наблюдение отдельной молекулыво флуоресцентной микроскопииФлуорохром – максимально стабильный(Qe/Qd>105).Объектив с максимальной светособирающейсилой (например, х60/1,45) .Квантовый выход камеры – не менее 70%;эквивалентный размер пиксела 0,1-0,15 мкм.Критерий: свечение не затухает постепенно, нопропадает внезапно и полностью.Флуоресцентные красителидля визуальных наблюденийФлуоресценция в диапазоне 450-630 нм.Возбуждение – УФ, синий свет (450-490 нм),зеленый свет (500-550 нм).Требования: малое время высвечиванияфлуоресценции (большая яркость).Флюоресцентные красителидля инструментальныхнаблюденийФлюоресценция в диапазоне 400-850 нм.Возбуждение – УФ (340-395 нм), фиолетовый свет(407 нм); синий свет (450-490 нм), зеленый свет(500-550 нм), желто-красный свет (570-640 нм),ближний ИК свет (730-780 нм).Требования: высокая фотостабильность, большойквантовый выход.Мерцающие красителиPALM – фотоактивируемые флуоресцентные белки.
Активация – какправило, фиолетовым светом (405 нм); возбуждение активированногобелка – зеленым светом, флуоресценция – в красной области (>580нм).Спектры возбуждения ифлуоресценции белка PAmKate.Поглощение до активации –сплошная линия, поглощениепосле активации (405 нм) –короткий пунктир.(Gunewardene et al., 2011)Мерцающие красителиСредняя флуоресценция (А)и спектры поглощения,возбуждения ифлуоресценции (В) белкаDronpa.(Dedecker et al., 2012)Вещества, защищающиефлуорохромы от выцветанияВеществоКомментарииНаиболее эффективен для FITC.
Также работает дляp-phenylenediamineRhodamine. Применяется в концентрации 0.1% вглицерине/PBS. Хранить в темноте, быстро разрушается насвету. Очень токсичен для кожи.DABCO(1,4-diazabi-Высокоэффективен для FITC. Несколько уступает p-cyclo-2,2,2-phenylenediamine, но более устойчив к свету и менее токсичен.octane)n-propylgallate2-mercaptoethylamineНаиболее эффективен для Rhodamine, Также работает дляFITC. Применяется в концентрации 1% в глицерине /PBS.Для окраски хромосом и ДНК с помощью propidium iodide,acridine orange, или Chromomysin A3. Применяется вконцентрации 0.1mM 2-mercaptotheylamine в Tris-EDTAАвтофлуоресценция живыхклеток (животных)Автофлуоресценция аминокислот – тирозин, триптофан,фенилаланин. Основные автофлуоресцирующие белки –коллаген, эластин.Возбуждение автофлуоресценции происходит в диапазоне 270490 нм.
Она практически отсутствует при возбуждении светом>500 нм.Эмиссия – синий свет (слабая), зеленый свет (средняя-сильная),желто-оранжевый свет (сильная).Автофлуоресценция клеток – в видимой области светят НАД-Н,рибофлавин, ретинол, липофусцин, меланин. Основныеорганеллы – предположительно лизосомы (не митохондрии!).Относительно яркой автофлуоресценцией обладают макрофаги,нейроны, мышцы, сперматозоиды.Автофлуоресценцияфиксированных клетокАвтофлуоресценция клеток может возрастать при фиксации(особенно сильно – при альдегидной).Для ее уменьшения можно использовать борогидрид натрия(свежеприготовленный раствор в ФФБ), или избегатьальдегидов в составе фиксатора (фиксация метанолом илиацетоном при низкой температуре и др.).Чтобы уменьшить влияние автофлуоресценции,целесообразно пользоваться длинноволновымикрасителями (эмиссия свыше 580 нм) или запирающимисветофильтрами с относительно узкой полосой пропускания.АвтофлюоресценциямиокардиоцитовАвтофлуоресценция доказывается широким спектромсвечения и отсутствием специфических окрашенныхструктур.Флуоресценция иавтофлуоресценция в клеткахрастенийЗеленый цвет – GFP-актин (трансфекция); красный –автофлуоресценция хлоропластовПрижизненные наблюденияПоддержание постоянной температуры - инкубатор.При использовании иммерсионного объективаобязательно его термостатирование.Поддержание баланса рН – добавление HEPES (10-25мМ) в среду с минимальным содержаниембикарбоната или подача СО2 в специальной камере,или использование специальных культуральных сред(так называемых, СО2-независимых)Уменьшение фотодеструкции – синхронизированныйс камерой затвор; снижение парциального давлениякислорода (оксираза).Уменьшение автофлуоресценции – использованиеспециальных культуральных сред (без витаминов идр.
добавок).Совместное использованиенескольких красителейВсе спектры флуоресценции органических красителей широкие.Поэтому при совместном использовании более двух красителей,как правило, возникает эффект перекрывания сигналов.При подборе красителей необходимо, чтобы расстояние междумаксимумами их эмиссий было не менее 40-50 нм. Желательно –60 и более нм.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
