Презентации лекций (1125719), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Оно осуществляется с помощью сложныхсистем фильтров. Конструкция системы фильтров являетсяноу-хау каждой фирмы.Иногда применяются трехматричные камеры, где разделениесвета между матрицами происходит с помощью пентапризмы.Некоторые камеры имеют охлаждение матрицы на 10-20градусов по сравнению с комнатной температурой.Квантовый выход не превышает 30%, обычно – не более 15%.Размеры матрицы – большие (1,3 – 10 млн. пикселей).Размеры ячеек маленькие – 6,45 мкм и менее.Оцифровка – 8 - 12 бит на цветовой канал (RGB).Основное предназначение – съемка при малых и среднихувеличениях.Рисунки,Крюков, 1946ВОЗ, 2001Обработанный снимокПриближение изображения квизуально воспринимаемому1 алгоритмСглаживание шумов камеры и изображения (Gaussian blur,радиус 1-1,5 пиксела).Наложение нерезкой маски (Unsharp mask, радиус 2-3 пиксела,коэффициент ~300%).Растяжение гистограмм в цветовых слоях RGB и гаммакоррекция.2 алгоритмПеревод изображения в формат L*a*b colorСглаживание шумов и наложение нерезкой маски (радиус 1,5-2пиксела, коэффициент ~150%) в слое LightnessРастяжение (небольшое) гистограмм в слоях a и b.Возвращение в формат RGB/CMYK.Исходный кадрПосле обработкиПосле фильтрации изображение делается более«объемным», но самые мелкие элементы из негоисчезают.Конфокальный микроскоп МинскогоСканирующийконфокальный микроскопИзображение формируется поточечно за счетпоследовательного сканирования препаратасфокусированным лазерным пучком.Сигнал от препарата детектируется ФЭУ,расположенным позади конфокальной диафрагмы.Изображение записывается в компьютер с помощьюАЦП и выводится на экран с помощью ЦАП.Генерация происходит также, как в телевизоре илисканирующем электронном микроскопе.Разрешающая способность определяется диаметромпучка и шагом сканирования.Конфокальный эффектИнтенсивность света от расположенных вне фокуса областейпрепарата быстро снижается, и они дают незначительныйвклад в формирование изображения – получается почтиидеальный оптический срез.Для достижения конфокального эффекта большая частьсвета, падающего на детектор, отсекается диафрагмой,поэтому яркость изображения снижается.Наилучший эффект должен достигаться при сканированиипрепарата относительно неподвижного пучка, нопрактически это крайне неудобно, и сканированиепроизводится качающимся лучом или с помощью дискаНипкова.Лазерный сканирующий конфокальныймикроскоп (схема)Блок развертки(качающиеся зеркала)xyВыходящийлучВходящийлучРазвертка луча (сканирование)Качающиеся зеркала обеспечивают поточечное сканированиепрепарата лазерным лучом, сфокусированным через объективмикроскопа.MRC-1024 сканирующая головаКолесосо светофильтрами32Луч света от лазераФЭУКонфокальные диафрагмы1Качающиеся зеркалаК объективу и от объективаКонфокальный блокустаревшего микроскопаСистема включает несколько лазеров и детекторов, переключениеосуществляется с помощью колес со светофильтрами.Физические ограничения вконфокальной микроскопииОтисточникаn1 photonsПИКСЕЛ – X,Yλ1α1δxδyδzВОКСЕЛ – X,Y,Zx,y,zα2Минимальныйразмер вокселаограничендифракционнымпределом (δx, δy, δz)λ2n2 photonsК детекторуFrom: Handbook of Biological ConfocalMicroscopy.
J.B.Pawley, Plenum Press, 1989Интенсивность света в перетяжкеПеретяжка в обычной иконфокальной микроскопииЗависимость конфокальногоэффекта от размера диафрагмыстандартнаянастройкаРазмер диафрагмы детектора измеряется в диаметрахпервого минимума диска Эри (AU – Airy units), то естьзависит от апертуры объектива.Перетяжка в конфокальноймикроскопииАBCDA – широкое поле, В – 4,3 диска; С – 2,5 диска; D – 0,7 диска ЭриВарианты конфокальныхсистем1. Лазерный сканирующий микроскоп (переменныедиафрагмы, изображение только электронное)2.
Тандемный микроскоп с диском Нипкова(постоянные диафрагмы, изображение реальное)3. Лазерный сканирующий микроскоп сосканированием в линии (одна диафрагмапостоянная, конфокальный микроскоп реальноговремени)Диск НипковаОтверстия в диске расположены по спирали и на равном угловомрасстоянии (α) друг от друга. На диске может быть несколькопараллельных спиралей.Конфокальные системыКонфокальные системыСканируюшаяС диском НипковаДетекторыВ лазерном сканирующем микроскопе –фотоэлектронный умножитель (ФЭУ).ФЭУ позволяет регулировать усиление, но имеетквантовый выход не более 20% в районе 500 нми низкий квантовый выход для красного света(>600 нм).В микроскопе с диском Нипкова – охлаждаемаяПЗС камера.Имеет высокий квантовый выход (60-90%) вшироком диапазоне (500-800 нм), ноотносительно низкий квантовый выход (около30%) в синем свете (450 нм).Сравнение конфокальныхсистем• Лазерная сканирующая микроскопия – регулируемыйконфокальный эффект, но низкая чувствительность;увеличение может изменяться за счет шагасканирования без смены объектива; простоеуправление обесцвечиванием (FRAP, FLIP).
Времяполучения изображения составляет секунды-десяткисекунд.• С диском Нипкова – фиксированный конфокальныйэффект (диаметр диафрагмы примерно равен дискауЭри для объектива х60); изображение в реальномвремени; большая чувствительность в желто-краснойобласти. Время получения изображения зависит толькоот камеры.Широкопольная и конфокальнаямикроскопия (толстые препараты)Широкопольная и конфокальнаямикроскопия (тонкий препарат)Микротрубочки в живой клетке. Слева - обычная флюоресцентнаямикроскопия; справа - конфокальная система с диском Нипкова.Параметры, определяющиекачество изображения1.
Отношение сигнал/шум.2. Настройки микроскопа (юстировка лазерногопучка, установка конфокальной диафрагмы,установка мощности лазера).3. Скорость сканирования (время экспозиции точкипри растровой микроскопии).4. Точность работы сканнера.5. Фотообесцвечивание.6. Затекание сигнала из соседних каналов.7. Автофлуоресценция препарата.8. Сферическая аберрация для толстых препаратов.Оценка скорости сканированияМаксимальное количество фотонов от одной молекулыFmax = S · Qe · Iнас · ∆ t [фотонов],Fmax :гдеS – площадь эффективного сечения молекулы;Qe – квантовый выход при данной длине волны возбуждающегосвета;Iнас – максимальная интенсивность потока возбуждающего света∆t– время освещения одного воксела (~10-6 c)Количество собранного света уменьшается пропорциональноквадрату апертуры объектива и степени закрытия диафрагмыперед детектором.При сканировании с максимально закрытыми диафрагмамимощность лазера должна быть близка к насыщающей, и времязаписи одного воксела должно быть достаточно велико.Лазеры для конфокальноймикроскопииГазовые лазеры – аргоновый (488, 514,5 нм и др.),гелий неоновые (541, 633 нм).Недостаток – ограниченное время жизни (5000 часови менее) маломощных лазеров.Диодные лазеры – индивидуальные длины волн.Время жизни зависит от мощности.
Оптимальнаямощность составляет более 50 мВт.Для ограничения мощности лазерного пучкаприменяется либо управление мощностью спомощью регулируемых акусто-оптическихзатворов, либо светофильтры..
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
