Презентации лекций (1125719), страница 11

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 11)

Как правило,проекционная линза имеет коэффициент х1, а системапереноса зрачка – больше единицы (например, х1,5).Лекция 11Цифровая микроскопия:получение цифровогоизображенияТеорема дискретизации(Sampling theorem)Для однозначного восстановления (передачи)непрерывного периодического сигнала с помощьюдискретной (цифровой) записи частота измерениясигнала (частота дискретизации) должна быть покрайней мере в 2 раза больше самой высокой частотыиз спектра исходного сигнала, которую надо передать.Пример: для передачи звука в цифровыхустройствах используется частота дискретизации 44кГц, поскольку максимальная частота звука,воспринимаемого человеком, составляет 20 кГц.Теорема дискретизации вмикроскопииДля записи изображения без потери информацииэквивалентный размер пиксела должен быть покрайней мере в 2 раза меньше разрешающейспособности микроскопа (радиуса диска Эри).Например, если разрешение микроскопа симмерсионным объективом х60/1,4 составляет0,24 мкм, то размер пиксела при записи долженбыть не более 0,12 мкм.На самом деле размер пиксела должен бытьсущественно меньше указанного выше, так какдиск Эри не описывается синусоидой, а матрицакамеры является двумерной.

Этот вопрос будетподробно рассмотрен далее.Ограничения дискретногоизображенияКонтраст дискретного изображения всегда меньше, чемнепрерывного. Основной вопрос – насколько? Так как научнаякамера позволяет записать больше градаций серого, чемразличает глаз, то при «восстановлении» изображения контрастможет быть увеличен.При достаточно малых эквивалентных размерах пиксела (около1/10 радиуса диска Эри) записанное изображение являетсяхорошим приближением оригинала, то есть контраст его малоотличается от исходного.При размерах пиксела свыше ¼ но менее ½ радиуса диска Эриконтраст изображения становится переменной величиной.

Онзависит от относительного расположения элементовизображения и матрицы камеры.При размерах пиксела больше ½ разрешающей способностиприбора, разрешающая способность системы существенноснижается и ограничивается исключительно величиной пиксела.Недостаточнаяпикселизация изображенияМаксимальный эквивалентный размер пиксела, диктуемыйтелеграфной теоремой (1/2 радиуса диска Эри), в случае, когдаобъекты разделены минимальным промежутком, приводит кзначительному снижению контраста при «удачной» пикселизации,и полной потере контраста при «неудачной» пикселизации.Пикселизация изображенияИсходя из критерия Рэлея, для сохранения контраста припроизвольном расположении точек в объекте, максимальныйэквивалентный размер пиксела должен составлять менее 1/3.2радиуса диска Эри.При размере пиксела равном 1/5 радиуса диска Эри, контрастснижается не более, чем в 1,5 раза.Максимально допустимыйразмер пиксела для основныхобъективовх100/1.3 (имм.) – 10 мкмх60/1.4 (имм.) – 5,6 мкмх40/1.0 (имм.) – 5,2 мкмх40/0.75 – 6,9 мкмх20/0.75 – 3,5 мкмх20/0.5– 5,2 мкмх10/0.3– 4,3 мкмСоотношение полей зрения256 К3 мегапикселаВидимое полеМикроскоп – общий видОтношение сигнал/шумМаксимальная величина отношения сигнал/шум являетсяхарактеристикой записывающей аппаратуры.Она обычно выражается в децибелах (логарифмическая шкала соснованием 10 – 10 дБ соответствуют SNR=10, 20 дБ – SNR=100 ит.д.).

Для идеального цифрового устройства SNR соответствуетразрядности АЦП (8 бит – 24 дБ; 12 бит – 36 дБ; 16 бит – 48 дБ).На практике максимальное отношение может ограничиватьсяусловиями съемки.Зависимость изображения от выдержкиОтношение сигнал/шум принизкой освещенностиВ условиях низкой освещенности (при использованиикамер с охлаждением, где темновой ток практическиотсутствует) при небольших экспозициях шум считыванияявляется основным источником неоднородностей.Отношение сигнал/шум лимитируется конструкциейкамеры и растет с ростом экспозиции почти линейно.При увеличении экспозиции (времени накопления сигнала)наступает момент, когда дробовый шум (случайныевариации в потоке фотонов, космические частицы)превышает шум считывания и темновой ток. С этогоуровня отношение сигнал/шум лимитируется дробовымшумом и растет медленнее.Зависимость отношениясигнал/шум от времениэкспозицииЗапись изображенияВекторная запись – изображение кодируется в видеформул, изменение масштаба не приводит кухудшению качества и позволяет увидеть новыедетали (MS Word; Adobe Acrobat).Поточечная (растровая) запись – количествоинформации однозначно определяется количествомточек (пикселов) в записанном изображении.Изменение масштаба делает растр видимым.Все ПЗС и КМОП камеры записывают изображение врастровом формате!Каждый пиксел растрового изображения однозначноописывается своим положением в кадре и яркостью.Для цветного изображения яркость рассчитываетсяраздельно в трех каналах.Гистограмма яркостиГрафик, показывающий распределение пикселов поинтенсивности, называется гистограмма яркости.

Взависимости от условий съемки она может иметьразличный вид.Типичные гистограммыФлуоресценцияФазовый контрастГистограмма яркостиГрафик, показывающий распределение пикселов поинтенсивности, называется гистограмма яркости. Взависимости от условий съемки она может иметьразличный вид.В светлом поле гистограмма имеет два или три пика,соответствующих фону и различным областямпрепарата.В режиме фазового контраста и DIC – один пик,соответствующий фону.В режиме флуоресценции – один пик, но чаще –спадающая от «0» кривая.Правильная настройка гистограммы яркостипозволяет эффективно проводить дальнейшуюобработку изображения.Запись изображения – режимсветлого поляОпределение экспозиции – по гистограмме яркости(объект и фон), или по условиям съемки.Настройка цветового баланса – накал лампы неменее 50% от максимального.Определение достаточного увеличения объектива(эквивалентного размера пиксела).Предварительная фокусировка изображения в«живом окне».Запись изображения –фазовый контраст и DICЯркость фона должна составлять около 50-70% отнасыщения камеры, или время экспозицииопределяется условиями эксперимента (живыеклетки).При съемке живых клеток для увеличения контрастацелесообразно использование зеленого илиоранжевого светофильтра.Предварительная фокусировка изображения в«живом окне».Запись изображения –режим флюоресценцииНастройка освещения – поле, освещаемое лампой, может бытьуменьшено до эквивалентного размера матрицы камеры.Определение экспозиции – как правило, экспозицияустанавливается максимально возможная по условиямэксперимента (живые клетки).

Фиксированные препараты –экспозиция устанавливается близкой к насыщению камеры(стандартные препараты – экспозиция не менее 1-5 сек. дляохлаждаемых камер).Настройка камеры – обычно не требуется, но для EMCCDнеобходима настройка усиления.Установка светоделителя – 100% света на камеру.Повторная съемка того же поля зрения нежелательна!Фокусировка в живом окне может быть затруднена – проверкупарфокальности надо проводить заранее.Условия оптимальной записиизображения в микроскопеУменьшение эквивалентного размера пиксела приводит куменьшению количества света, попадающего на него, чтоаналогично эффекту уменьшения чувствительности камеры.Поэтому минимальный уровень пикселизации вофлуоресцентной микроскопии, составляет около 1/3 радиусадиска Эри, но меньший эквивалентный размер пикселапозволяет сохранить больший контраст.В практической флуоресцентной микроскопии эквивалентныйразмер пиксела рассчитывается исходя из требованийсветочувствительности.

Компромисс обычно достигается приэквивалентном размере пиксела около 40% от разрешающейспособности объектива, однако для ярких препаратов егоцелесообразно уменьшить до 25-30%.Для эффективной цифровой обработки светлопольныхизображений эквивалентный размер пиксела должен быть неболее ¼ разрешающей способности объектива микроскопа.Получение изображенияОсновные этапы:Определение необходимого разрешения (объектива иэквивалентного размера пиксела).Установка освещения (по Келеру).Настройка гистограммы яркости – подбор экспозиции инастроек камеры для получения максимального отношениясигнал/шум.Запись изображения в формате TIFF (другие нежелательны),максимальное число бит на канал (ограничивается АЦП иконтроллером камеры).

Если прямая запись в формате TIFF смаксимальной разрядностью невозможна (режим RAW илианалогичный), то необходимо выяснить, как можно данныйформат преобразовать в TIFF без потери разрядности.Вывод изображения на экранИзображение, записанное с динамическим диапазоном 8 бит,теоретически может быть выведено на экран полностью, но невсе его оттенки воспринимаются глазом.Изображение, записанное камерой с динамическим диапазоном12-16 бит, содержит большое количество скрытой информации,которая не отображается монитором.Светлые полутона воспринимаются глазом лучше, чем темные,поэтому изображение при выводе на экран частомодифицируется нелинейным образом (гамма-коррекция).Низкий контраст изображения может быть обусловленпрепаратом, а может быть связан с неправильной настройкоймикроскопа и камеры.Для увеличения контраста записанного изображения применяютразличные обработки.

Некоторые из них не приводят к потереинформации, а другие приводят.Разрядность АЦП ипросмотр изображенияИзображение с разрядностью более 8 бит нельзя целикомвывести на экран, поскольку монитор отображает только 8 бит.«Стандартное» выведение изображения предполагает, что весьдинамический диапазон выводится за счет объединениясоседних уровней.Более правильное выведение – изображение «шкалируется» поминимуму и максимуму.Для детального просмотра полутоновых деталей (градацийсерого) шкала должна быть настроена специальным образом(scale image), что достигается с использованием программ,работающих с 16-и битным изображением.Суррогатная настройка изображения – регулировка яркости иконтраста в 8-и битной шкале.Лекция 12Обработка изображений,работа с цветнымиизображениямиСтандартная последовательностьанализа изображений••••••Импорт изображенийКоррекцияУсиление контраста и предобработкаСегментация (выделение объектов)ИзмеренияКлассификация признаковКоррекция изображениядоДеконволюция– Слепая (расчетная PSF)– Итеративная (эмпирическая PSF)– 3D деконволюцияHyugens, www.svi.nlКоррекция хроматическихаберрацийКоррекция фона– На плоское поле– Неравномерное освещениепослеНеоднородности поля зренияВиньетирование.Неравномерное освещение поля зрения (сцены).Помехи в оптическом пути и загрязнения на входномокне камеры.Дробовый шум (при низкой освещенности).Неравномерный фиксированный фон (дефектныепикселы матрицы камеры).Нелинейная светочувствительность матрицы иэффект «затекания» при насыщении.ВиньетированиеВиньетирование – затемнение изображения по краям кадра.Причины: зависимость освещенности от угла падения света(пропорциональна косинусу в четвертой степени);механические (косой свет затемняется из-за несовершенстваоптической системы); оптические (рассеяния косого света намногочисленных поверхностях линз); зависимостьчувствительности фотодиодов от угла (устраняется спомощью микролинз).В микроскопии эффект виньетирования зависит от угловогоразмера матрицы камеры, и возрастает с ростом ее полязрения.

Характеристики

Список файлов лекций