А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 145
Текст из файла (страница 145)
Среде дают застьпь на строго горизонтальной поверх- Т а б л и ц а 46.2 Рекомеидуемые объемы иоды дяя оиредедеиия микробного числа 486 ности. Посевы вырашивают в течение суток при 37 С. Воду из открытых водоемов засевают параллельно на две серии чашек, одну из которых инкубируют при 37'С в течение суток, а другую — 2 сут при 20 С. Затем подсчитывают количество выросших па поверхности и в глубине среды колоний (видимых невооруженным глазом и при увеличении в 2 — 5 раз) и вьпгисляют микробное число воды — количество микроорганизмов в 1 мл. Питьевая вода считается хорошей, если общее количество бактерий в 1 мл не более 100; сомнитсльной— 100 в 150; загрязненной — 500 и более.
Определение коли-титра и коли-индекса воды. Коли-титр — минимальное количество воды (мл), в котором обнаруживаются БГКП. Коли-индекс — количество БГКП, содержащихся в 1 л исследуемой воды (по международному и европейскому стандарту — в 100 мл). Эти показатели определяют двухэтапным бродильным (титрационным) методом или методом мембранных фильтров.
Бродильный метод — основан на посеве определенных объемов анализируемой воды и подращивании при 37 С в средах накопления с последующим высевом бактерий на плотную среду Эндо, дифференцировании выросших бактерий и определении наибольшего вероятного числа бактерий группы кишечных палочек (БГКП) в 1 л воды по таблицам.
При исследовании воды открытых водоемов, а также воды на этапах очистки и обеззараживания засева~от 100,0; 10,0; 1,0 и 0,1 мл. Для исследования водопроводной воды засевают три объема по 100,0 мл, три объема по 10,0 мл и три об'ьема по 1,0 мл. Укаэанные объемы воды помешают во флаконы или пробирки со средой Кесслера или КОДА, снабженные поплавками или комочками ваты, погруженными на дно сосуда. Посев 100,0 и 10,0 мл воды производят во флаконы и пробирки соответственно с 10,0 и 1,0 мл концентрированной среды; посев 1,0 и 0,1 мл воды в пробирки с 10,0 мл среды нормальной концентрации. Посевы инкубируют 24 ч при 37 'С. Отсутствие помутнения и образования кислоты и газа во флаконах и пробирках позволяет получить отрицательный результат и закончить исследование. Из каждого флакона или пробирки, в которых замечены помутнение, кислота, газ, делают посев петлей на поверхность среды Эндо, разделенной на 3 — 4 сектора.
Посевной материал следует брать с таким расчетом, чтобы получить изолированныс колонии. Чашки инкубируют при 37 С в течение 16 — 18 ч. При отсутствии роста, а также при наличии колоний, не характерных для бактерий группы кишечной палочки (пленчатых, губчатых„с неровными краями и поверхностью, плесневых и др.), считают результат отрицательным. Из выросших на среде Эндо красных, розовых, бледно-розовых колоний с металлическим блеском или без него (лактозоположительные колонии) делают мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазньтй тест, позволяющий дифференцировать БГКП от грамотрицательных бактерий семейства Ваеис1ошопас1асеае и других оксидазоположительных бактерий, обитаюших в воде. С этой целью 2— 3 изолированные колонии снимают с поверхности среды стеклянной палочкой, наносят штрихом на фильтрованную бумагу, смоченную раствором диметилп-фснилендиамина.
При отрицательном оксидазном тесте цвет бумаги не изменяется, при положительном она окрашивается в синий цвет в течение ! мин. Наличие грамотрицательных палочек в мазках и отрицательный оксидазный тест позволяют немедленно дать положительный ответ о наличии БГКП 487 при анализе воды на этапах очистки и воды открытых водоемов. При исследовании водопроводной воды грамотрицатсльныс палочки, не образующие оксидазу, вновь исследуют в бродильном тесте, внося петлей посевной материал в полужидкий питательный агар с 0,5% глюкозы, и инкубируют при 37'С в течение суток.
При наличии кислоты и газа получают положительный результат. Результат анализа выражают в виде коли-индекса, величину которого определяют по табл. 46.3 и 46.4. Зная коли-индекс, рассчитывакгг коли-титр по формуле 1000 коли-зизр = коли-индекс Таблица 46.3 Определение коли-индекса при исследовании воды Таблица 46.4 Определение коли-индекса при исследовании питьевой воды Оканчаиие табл.
4б. Метод мембранных фильтров. Сущность метода заключается в концентрировании бактерий из определенного объема анализируемой воды на мембранный фильтр, выращивании их при 37 С на среде Эндо, дифференцировании выросших колоний и подсчете бактерий группы кишечных палочек в 1 л воды. Воду из водопроводной сети и воду из артезианских скважин фильтруют в объеме 333 мл . Чистую воду открытого водоема Фильтруют в объеме 100; 10; 1 и 0,1 мл, более загрязненную — 0,1; 0,01 и 0,001 мл. Для фильтрования воды испслюуют мембранные фильтры 1чяЗ !диаметр нор 0,7 мкм), помещают их в стеклянный стакан с подогретой до 80 С дистиллированной водой и ставят на слабый огонь ло закипания.
Кипячение фильтров производят трижды по 10 мин. После первого и второго кипячения воду сливают. После последнего кипячения воду не сливают и фильтры оставляют в ней до употребления. Перед работой Фильтровальный аппарат Зейтца протирают спиртом. Фильтр помещают в воронку фильтровального аппарата, который присоединен к вакуум-насосу. Начинаю~ исследования с больших разведений. При посевах объемов 1 мл и меньше их разводят в 1О мл стерильной водопроводной воды, а затем фильтруют. После окончания процесса фильтры укладывают на поверхность среды Эндо в чашках Петри фильгрующей поверхностью вверх.
На одну чашку можно помещать 3 — 4 фильтра. Чашки с фильтрами выдерживают 18 — 24 ч при 37 С. Для подсчета выбирают Фильтры с числом колоний не менее 1О и не более 50. Учету подлежат все красные или темно-красные 489 колонии с металлическим блеском или без него. В дальнейшем схема подтверждения принадлежности выделенных бактерий к группе кишечных палочек аналогична описанной для бродильного метода. Материалы, посуда, реактивы, оборудование Стерильные чашки Петри; стерильные пробирки; стерильные пипетки; стерильные бутылки или флаконы емкостью 500 ьш; стаканчики стеклянные термостойкие; колбы или флаконы емкостью 150 — 250 мл; палочки стеклянные) пинцеты; петли бактериологические; лупа; барометр; фильтровальная установка; фильтры мембранные № 3; бумага Фильтровальная; вата; микроскопы; стекла предметные и покровные; термостаты на 30 и 37 С.
Стерильный 0„85%-й раствор 1'1аС1 (или вода водопроводная стерильная); среда Эндо; среда Кесслера или КОДА; МПА; полужидкая среда с глюкозой, свежеприготовленный раствор диметил-и-фенилендиамина; свежеприготовленный 3%-й раствор КОН; гипосульфит натрия; реактивы для окраски по Граму; Фуксин; 70%-й эта нол. ЗАДАЧА 2. САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЧВЫ Попавшие в почву представители нормальной микрофлоры человека и животных, а также патогенные микроорганизмы обычно длительно не выживают. Однако многие представители нормальной микрофлоры человека способны включаться в состав биоценоза почвы, а отдельные виды остаются постоянными обитателями.
На сроки выживания патогенных бактерий в почве влияют состав и тип почвы, температура, влажность, атмосферные осадки, степень загрязненности, а также ее характер (органическое, микробное или химическое загрязнение). Патогенные микроорганизмы, обнаруживаемые в почве, разделяют на три группы (А.3. Байчурина и др., 1998): ! . Патогенные микроорганизмы, постоянно обитаюшие в почве (например, С!агггЫ!ит Ьогидпит, возбудители подкожных микозов, виды Ас!!потусег, некоторые возбудители микотоксикозов). 2. Спорообразующие патогенные микроорганизмы (Ваей!ил ап!Ьгас!А С!ов!тПит !е(ат, виды С!га!пг!!ит, вызывающие анаэробные инфекции).
Бактерии попадают в почву с выделениями человека и животных, а также с трупами погибших животных. При благоприятных условиях опи могут размножаться и сохраняться в виде спор длительное время. 3. Патогенные микроорганизмы, попадающие в почву с вьшелениями человека и животных и сохраняющиеся сравнительно недолго (в течение нескольких недель илп месяцев).
Это различные неспоровые бактерии (виды Ха!топе!!а, Я !8е!!а, ИЬпо„Вгиее!!а, ргапейеда, МуеоЬас!ег!ит, Вераприа, рлеих!отопил, энтеровирусы, вирус яшура). Оценку санитарного состояния почв проводят с учетом комплекса показателен; гюдсчитывают общее количество сапрофизных микроорганизмов и определяют наличие санитарно-показательных микроорганизмов (ВГКП, С!ов!г!х)!и!и ре~лпйепз и др.).
Высокая численность сапрофитной микрофлоры свидетельствует об органическом загрязнении, при микробной контаминации преобладают санитарно-показательные микроорганизмы. При необходимости также исследуют состав нитрифицируюших и аммонифицирующих бактерий, актиномицетов, грибов, целлюлозолитических микроорганизмов и др. авхжйыьс о о -х почвы по результатам определения общего микробного числа, коли-титра.
перфрингенс-титра и количества термофильных бактерий. 490 Ход выполнения задачи Подготовка сред и материалов. Подготовить к стерилизации (в расчете на одного студента): чашки Петри — 12 — 15 штл пробирки — 15 штл пипетки на ! — 2 мл — 10 шт., на 5 — 10 мл — 3 штб колба на 300 — 500 мл — 1 штл банка или пакет (вместимостью -1000 мл) — 1 шт. Приготовить (состав и приготовление сред см.
в приложении 4): вода водопроводная стерильная — 350— 400 мл (из них 270 мл отдельно в колбе на 500 мл); МПЛ стерильный — 150— 200 мл; стерильное обезжиренное молоко — 30 мл (разлить в пробирки по 5 мл) или среда Вильсона — Блера 60 мл; полужидкая среда с глюкозой — 30 мл (разлить в 3 пробирки по 7 — 10 мл); среда КОДА или среда Кссслсра (нормальной концентрации) — 60 мл (разлить по 10 мл в 6 обычных пробирок), в каждую пробирку поместить по поплавку или комочку ваты; среда Эндо— 20 — 60 мл (сразу после приготовления разлить в стерильные чашки Петри, дать застыть, завернуть в бумагу и оставить в холодильнике). Отбор проб и определение микробного числа.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
