А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 140
Текст из файла (страница 140)
Некоторые молочнокислые бактерии способны разлагать образующуюся при использовании определенных субстратов перекись водорода благодаря наличию у них каталазной активности, осуществляемой так называемой псевдокаталазой. Псевдокаталаза обнаружена у штаммов Рейососсж реп!охасеиз, Реисопох!ос тезеп!егоЫех, Яас!оЬас/Пихр/апгагит при выращивании их на питательном агаре с 0,5 % глюкозы. Второй фермент, разрушающий перекись, каталаза, найден у ряда молочнокислых бактерий только при выращивании их на среде, содержащей прогретую кровь или гематин. Физиологической особенностью молочнокислых бактерий является их кислотоустойчивость, как следствие характерного для них энергетического обмена. Кокковые формы могут развиваться в нейтральных и щелочных средах, большинство же пшючковидных форм не способны расти в среде с рН выше б,О; бифидобактерии не растут при рН выше 8,2.
Рост всех мслочнокислых бактерий продолжается до тех пор, пока в процессе брожения углеводов рН в среде не снизится до 5,0 и ниже. В результате жизнедеятельности гомоферментативных лактококков накапливается до 1%, а И.Ьи/8апсих — до 3,5% молочной кислоты. Молочнокислые бактерии обладаюг определенной протеолитической активностью, обусловливаемой действием внеклеточных и внутриклеточных протеиназ и пептидаз.
Протеолитическую активность проявляют как кокковые формы, так и лактобактерии, включая термофилов. Молочнокислые палочковидные бактерии обладают большей протеолитической активностью, чем кокковые формы. Например, У,. /ас!/з зцЬзр. сазе/ могут переводить до 25 — 30% казеина в растворимую форму, тогда как /..
/ас!/х зцЬзр сгетопх и 7, зцЬзр /асг/х— ! 5 — 17 %. Гидролиз молочнокислыми бактериями большинства пептидов (например, !Ч;аланилглицина и глицил-РА-аланина) сильно стимулируется ионами кобальта при рН 5,5 — б,О. Молочнокислые бактерии либо вовсе не обладают липолитической активностью, либо проявляют ее в определенной степени при воздействии на некоторые субстраты. Штаммы многих видов лактококков (Л. /ас!/з, 1. а-евог/з, У.. Йасе!1/аспя, 5!герюсоссия !ЬеггпорЬ/!и~, а также Хеисопоиос тегелг«т0Ыег, Рег/воксия сегеиаае) и лактобацилл (ЕЬ. Ье!ге//сиз, /Ь. г/е/Ьгисс/гл', 1Ь. сазе!, /Ь.
релшгл5н ЛЬ. Ьгег/х) в качестве субстрата используют некоторые триглицериды. Следует отмстить, что молочнокислые бактерии явились объектом, с помощью которого были открыты некоторые новые жирные кислоты. Изучая природу жирных кислот у отдельных лактобацилл, установили, что «свободные» и «связанные» липиды, извлеченные из П. агаЬ/логик, содержат пальмитиновую, стеариновую, а также ранее неизвестную жирную кислоту — лактобацилловую (С,~ Н,б 02). Отдельные виды лахтобацилл (7Ь. |егтелг/, /.'Ь. сазе/, И.
за/!гапи, /Ь. иг/г/егсепз) способны образовывать внекюточные нуклеазы при выращивании на агаре, содержащем ДНК или РНК. Судя по величине диаметра светлых зон вокруг колоний на агаре с ДНК (зоны до 3 — 4 мм) некоторые штаммы АЬ. ~егтеп/1 характеризуются значительной ДНКазной активностью. Иногда лактобациллы синтезируют одновременно и внеклеточныс ДНКазы и РНКазы. 471 Если способность к образованию ацетоина достаточно распространена у молочнокислых бактерий, то пггаммы, образующие диацетил в значительных количествах, встречаются достаточно рсдко.
Все извсстные штаммы, синтезирующие диацетил, образуют и ацетоин, однако, если штамм образует ацстоин, это ещс не значит, что при этом синтезируется и диацетил. В основном молочнокислые бактерии культивируют на средах с шсстиуглеродными сахарами, но они могут также сбраживать некоторыс пятиуглеродныс сахара, сахароспирты, органические кислоты и позпгсахаридьь Отличительным признаком молочнокислых бактерий является высокая потребность в сложных питательных всществах, опрсдвлснных аминокислотах, витаминах, особенно группы В.
Наиболсс важным источником энергии для молочнокисльтх бактерий являются моно- и дисахариды — глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза, но одновременно они не сбраживают трисахарид рафинозу и пентозу ксилозу. Используют в качестве источника энсргии и в конструктивном обмене также органические кислоты, такие, как лимонную, яблочную, пировиноградную, фумаровую и др. Свойство сбраживать различные сахара и органические кислоты, в частности рибозу, цитрат или ацетат, лежит в основе отличительных тестов для идентификации молочнокислых бактсрий.
44.2Л. Определение количества молочной кислоты Количество молочной кислоты определяют методом титрования и по разности между объемами 0,1 н. раствора ХаОН, пошедшего на титрованив среды культивирования до и после роста бактерий. Для титрования берут 10 мл культуральной жидкости или обрата, помещают в колбу Эрлснмейсра, добавляют 20 мл дистиллированной воды, 1 — 2 капли фенолфталсина и титруют 0,1 н. раствором ХаОН при постоянном взбалтывании до появления устойчивой слабо- розовой окраски.
Кислотность молока или культуральной жидкости выражают в градусах Тсрнсра ('Т) или процентах молочной кислоты. Так, 1 Т соответствует 1 мл 0,1 н. раствора ХаОН, пошедшего на титрование 100 мл исследуемой среды. Общее содержание молочной кислоты выражается в процентах. Поскольку известно, что молекулярная масса молочной кислоты составляет 90„то для приготовления 1 л 1 н. раствора требуется 90 г кислоты, значит, в 1 мл О, ! н.
раствора содержится 0,009 г кислоты, что соответствует 1 Т. 44.2.2. Качественная реакция на молочную кислоту Принцип реакции состоит в переводе молочной кислоты в уксусный альдегцд в кислой среде при температуре кипения в присутствии псрмангапата КМпОх и взаимодействия альдегида с аммиачным серебром, дающего реакцию ~серебряного зеркала». Для проведения реакции культуральную жидкость или сброжснный обрат фильтруют через бумажный складчатый фильтр. Берут 5 мл филь- трата, помещают в колбу Эрлснмсйера, добавляют 2 мл крепкой серной кислоты и„взбалтывая„нагревают на асбестовой сетке до начала кипения.
Затем, продолжая гюмешиванис, по каплям пипеткой добавляют 5 мл 5%-го раствора КМп04, который в процессе реакции обесцвечивается. При этом молочная кис- 472 лота переходит в уксусный альдегид. Для проведения характерной реакции быстро покрывают горлышко колбы фильтровальной бумагой, смоченной аммиачным раствором нитрата серебра Абаз. Фильтровальную бумагу аккуратно прижимают к краям колбы, продолжая нагревание. Уксусный альдегид улетучивается и, вступая в реакцию с аммиачным раствором А8НОь вызывает почсрнение бумаги серебристыми разводами (выделяется металлическое ссребро). Аммиачный раствор нитрата серебра А8ЬОз готовят следующим образом: к 1 — 2 мл 10%-го раствора А8ЬО, в пробирке приливают по каплям аммиак, что приводит к выпадению осадка Ая,О, постепенно растворяющегося далее в избытке аммиака.
44.3. ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ вяОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ Молочнокислые бактерии, обитающие в природных и производственных субстратах, обычно не занимают доминирующего положения, над ними превалируют различные сапрофитные микроорганизмы, такие, как грамотрицательные бактерии, споровые и бесспоровые формы, кокки, дрожжи, плесени. Поэтому для их выделения используют злективные питательные среды, способствукпцие их росту и угнетающие рост сопутствующей микрофлоры.
В качестве ингибиторов роста посюронней микро- флоры в среды добавляют сорбнновую и уксусную кислоты, спирт, азид натрия и др. Источниками для выделения лактококков служат кисломолочные продукты (сметана, простокваша, сыры, кефир и др.), лактобацилл — силос и травы, пищевые продукты и фекалии. Для определения присутствия и учета молочнокислых бактерий навеску испытуемого материала разводят в физиологическом растворе н высевают в жидкие накопительные среды или же сразу на твердые агаровые среды лля подсчета их количества. Известна высокая питательная ценность сред из гидролизата молока, пригодных для учета и выделения молочнокислых бактерий. Для приготовления гидролизата берут 1 л пастеризованного при 85 С и охлажденного до 45 С обезжиренного молока, доводят активную кислотность 40%-м водным раствором НаОН до рН 7,4 — 7,6, добавляют к нему 1 г порошка панкреатина и 5 мл хлороформа и помещают в тсрмостат на 40 С на 72 ч.
Затем гидролизат фильтруют, устанавливают рН„равным 7,0 — 7,2, и стерилизуют при 1 атм в течение 10 мин. Для приготовления агаризованных сред гидролизат разводят в два раза водопроводной водой, добавляют 2„5% дрожжевого автолизата и 2,0% агарагара. Учет количества бактерий облегчается при добавления в среду инкубирования 2 мл 0,1%-го раствора индикатора бромкрезолового пурпурного или мела (100 мл 3%-й суспензии углекислого кальция на 1 л), образующих при глубинном инкубировании прозрачную зону просветления вокруг колоний. Для выделения ароматообразуюших лактококков 7,. 1аслх зпЬзр.
г11асег11асг(з из исследуемых образцов в гидролизат молока добавляют 1% лимоннокислого натрия. После культивирования бактерий в этой накопительной среде в течение 18 — 24 ч при 30 С суспензию высевают глубинным посевом на агаризованную среду того же состава. По пузырькам газа, выделяющегося при использовании цитрата, находят колонии этих лактококков. Для выделения слизеобразующих бактерий 7еисолозгос глеюелгего1с(ез в эту же среду добавляют 1 % сахарозы. При разделении смешанных культур лактококков рекомендуют среду Редди с аргиливом следующего состава (%): триптон — 0,5; СаСОз — 0,3: КМЦ вЂ” 0,6 473 (карбоксиметилцеллюлоза для суспендирования СаСОз); К2НРО« — 0,1; дрожжевой экстракт — 0,5; Л-аргинин солянокислый — 0,5; агар-!,5; рН после стерилизации при 1 атм в течение 15 мин должен быть б,3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
