А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 143
Текст из файла (страница 143)
В качестве единственного источника углерода и энергии микроорганизмы при этом используют углеводороды нефти. 45.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИЙ РОДА СУТОРНАСА Известна способность углеводородокисляющих бактерий рода Суюрйада разжижать поверхность агаризовигной среды, поэтому для доказательства утлеводородокисляющей активности производят посев этих культур на среду с силикагслем в качестве уплотнителя. 479 Культивирование бактерий рода Суйуггаяа иа среде с еиликагелем.
Силикагель готовят следующим образом: к соляной кислоте с плотностью И = 1,1 добавляют при перемешивании равный объем раствора жидкого стекла (1чаз81Оз или Кт81Оз) той же плотности. Смесь разливают в чашки Петри по 20 — 30 мл в каждую и оставляк~т чашки на горизонтальной поверхности на несколько часов до образования кремне- кислого геля. Затем открытые чашки Петри помещают в стеклянный нли эмалированный сосуд и промывают в течение 2 — 3 сут проточной водой для удаления хлоридов, а потом несколько раз горячей дистиллированной водой. Об отсутствии хлоридов судят по качественной пробе цромывных вод с 1%-и раствором азотнокислого серебра: при наличии хлоридов образуется белый осадок ЛйС1ь Чашки с силикагелевыми пластинками до употребления сохраняют под водой.
Отмытые от хлорида пластинки пропитывают 2 мл концентрированной минеральной среды, содержание компонентов в которой в 7,5 раз выше, чем в соответствующей среде. Затем чашки с гелевыми пластинками помешают открытыми в сушильный шкаф и подсушивая>т при 50 — б0 С, следя за тем, чтобы гель не растрескался и его поверхность осталась влажной.
Перед посеволи чацгки заворачивают в бумагу и стерилизуют в автоклаве при 0,5 ати 15 мин. Посев микроорганизмов осуществляют обычным образом: на поверхность силикагелевой пластинки, пропитанной концентрированным раствором ьп1нератьпой среды, наносят субстрат в виде нефти или ее легких фракций и засевают культурой. Процесс подготовки силикагелевых пластинок является трудоемким и не предусматривает их длительного хранения, поэтому на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ был разработан оригинальный способ моделирования плотной среды с использованием поролона, пропитанного минеральной средой с сырой нефтью.
Этот материал был выбран по следующим причинам: поролон не используется известными бактериями; является гидрофобным материалом, что обеспечивает абсорбцию нефти или ее легких фракций; он обладает пористой структурой, а зто способствует хорошему водно-солевому и воздушному обмену, выдерживает стерилизацию в автоклавах.
Из поролона толщиной 3 — 4 мм готовят диски диаметром 5 — 10 см и стерилизуют автоклавированием при 1 атм во влажном состоянии. Затем диск помещают в чашку Петри, пропитывают стерильной минеральной средой, равномерно наносят нефть и засевают углеводородокнсляющие микроорганизмы с помощью бактериологической петли. На поверхности и в толще по1юлона наблюдают рост бактерий. Культивирование выделенных углеводородокисляющих микроорганизмов в жидкой среде. Для доказательства углеводородокисляющей активности бактерий рода С)торйа8а (помимо культивирования на силикагеле и поролоне) культуры высевают на жидкие минеральные среды с сырой неФтью, соляровым маслом, дизельным топливом и керосином (1 — 2%) в качестве единственного источника углерода и энергии.
По мере накопления биомассы и уменьшения субстрата (сырой нефти, керосина, дизельно~о топлива или солярового масла) судят о способности выделенных культур окислять углеводороды. Среднюю удельную скорость роста К за определенный промежуток (0 — га) вычисляют по формуле К = 2,303 (1оЫт, — 1оРла)/0 — гм где та и и, — начальная и конечная масса клеток, связанная обратной зависи- мостью со временем генерации (8 = О,б93/К). 480 45.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ НЕФТИ В ПОЧВЕ Анализ содержания нефти и нефтепродуктов в почве осуществляют гравиметрическим методом после экстракции хлороформом. Остаточную нефть и продукты ее окисления трижды экстрагируют из образцов хлороформом в соотношении 1: 3 (по объему). Экстракты смешивают и во флаконах с известным весом помещают для испарения хлороформа под тягу на 24 ч, взвешивают и сравнивают с контролем.
45.5. ОЦЕНКА МИКРОБНОЙ ДЕСТРУКЦИИ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Микробную деградацию нефти и нефтепродуктов оценивают по изменению их концентрапий после разделения отдельных фракций на хроматографической колонке. Проводят определение группового фракционного состава нефти и нефтепродуктов до и после развития бактерий. Групповой фракционный состав нефти или нефтепродуктов (керосина, дизельного топлива, солярового масла) определяют методом жидкостно-адсорбционной колоночной хроматографии с использованием двойного сорбента.
Нефть или нефтепродукт (около 0,4 г в порции) разделяют на колонке (диаметром 8 мм) с двойным сорбептом (внизу— окись алюминия, высота 2 см; вверху — силикагель фирмы «Сйетаро(» (Чехия), 40/100 мкм, высота 1,5 см). Колонку набивают сухим способом и уравновешивают гексаном, субстрат наносят в виде раствора в 1 мл гексана. В качеоляе зягоента дслользуют лоследовагяельмо смеси: 5 мл гексана; 5 мл смеси гексан; бензол (1; 1 по объему); 8 мл бензола; 5,5 мл смеси бензол:этанол (10: 1); 200 мл смеси бензол:этанол (1: !). Скорость элюции — 20 мл/ч. Фракции собирают и анализируют на регистрирующем УФ-спектрофотометре 200 — 20 (Ноас!г1, Япония), в кюветах с длиной оптического пути 10 мм в диапазоне длин волн 190 — 380 нм и выражают в процентах убыли субстрата.
Глава 46 САНИТАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ Санитарная микробиология изучает микрофлору окружающей среды (воды, воздуха, почвы, продуктов питания и предметов обихода) и ее влияние на здоровье человека. Эта наука представляет собой смежную с эпидемиологией и гигиеной область медицинской микробиологии. Основные санитарно-микробиологические методы включают в себя как оригинальные методики, так и методы общей и медицинской микробиологии, и направлены на определение общей микробной обсемсненности (обшее микробное число); обнаружение и титрование санитарно-показательных микроорганизмов (СПМ); выявление патогенных микроорганизмов и их метаболитов! определение степени недоброкачественности изучаемых объектов, обусловленной наличием микроорганизмов. Для оценки санитарно-эпидемическою состояния внешней среды в настоящее время используют летадм прямого обнаруэсеяия патогенных микроорганизмов (посев на пи- 481 !бн и тательные среды, гибридизация нуклеиновых кислот, полимеразная цепная реакция, серологические, биологические и др, методы), а также методы, позволяющие получить косвенную оценку возможного присутствия возбудителя во внешней среде (определение общего микробного числа и содержания СПМ).
Прямое обнаружение патогенон — наиболее точный показатель неблагополучности исследуемого объекта. Однако выделение патогенных микроорганизмов из объектов окружающей среды затруднено из-за наличия в них большого количества сапрофитов, которые препятствуют росту патогенной микрофлоры на питательных средах. Серьезно осложняет процесс анализа неравномерное распределение патогенов в окружающей среде.
Кроме того, в условиях внешней среды происходят генетические процессы (мутации, трансформация, трансдукция и др.), которые приводят к изменению исходных и формированию новых признаков патогенных микроорганизмов. К сожалению, даже современные методы не гарантируют успеха при незначительном содержании патогенов в исследуемых обьектах. Б связи с этим исследования на патогенную микрофлору в санитарной микробиологии проводят только по эпидемическим показаниям, и санитарно-микробиологические исследования, как правило, имеют целью не обнаружение патогенов, а поиск косвенных показателей неблагополучия объектов внешней среды.
Для санитарной оценки микробной обсемененности применяется определение общего микробного числа (ОМЧ). Под ОМЧ понимают количество колоний, вырастающих на МПА в чашках Петри после определенного срока инкубации при той или иной температуре из 1 мл (цля гнердых субстратов 1 г) исследуемого материала.
Таким образом, чаще всего учитываются мезофильные аэробные и факультативно-анаэробныс микроорганизмы (МАФАМ), способные расти на МПА. Предполагается, что чем большс объект загрязнен органическими веществами, тем выше ОМЧ. Определение ОМЧ широко используется для санитарной оценки воды и почвы, хотя при этом значительное количество почвенных и водных микроорганизмов не учитывается (выпадают из учета анаэробы, грибы, серные, азотфиксирующие, нитрифицирующие и другие бактерии). При необходимости для учета этих микроорганизмов используют соответствующие питательные среды. Общее количество микроорганизмов также можно определип путем прямого подсчета под микроскопом или с помощью специальных электронных счетчиков.
Определение санитарно-показательных микроорганизмов (СПМ) — специфический метод санитарной микробиологии, К СПМ относят представителей облигатной микро- флоры организма человека и теплокровных животных, обитающих в' кишечнике или воздушно-дыхательных путях. В качестве СПМ мог>т выступать не все прецставители нормальной микрофлоры человека и животных, а ли>иь те, которые уцовлетворяют следующим требованиям (А.И. Коротяев, С.А. Бабичев, 1998; А.3. Байчурина и др., 1998; О.К. Пощеев, 200!): ° постоянно присутствуют в выделениях человека и теплокровных животных и попадают в окружающую сред> в больших количествах; не имеют иного природного резервуара, кроме организма человека или животного: не размножаются активно во внешней среде (исключая пищевые продукты); выживают во внешней среде несколько больше, чем патогенные микроорганизмы: не имеют во внешней среце «двойников» или аналогов, поэтому исключена путаница; ° не изменяют сколько-нибудь значительно свои биологические свойства в окружающей среде; растуг на питательных средах независимо от влияния других присутствующих микроорганизмов; ° распределены в объекте внешней среды по возможности равномерно (плотные объекты при исследовании подвергаются гомогенизации); ° могут быть обнаружены, идентифицированы и количественно учтены современными, простыми и легко доступными методами; встречаются в организме хозяина и во внешней среце в значительно больших количествах но сравнению с соответствующими патогенными микроорганизмами.
482 Предполагается, что чем больше объект загрязнен экскрементами человека и животных, тем больше будет СПМ и тем вероятнее присутствие патогенов, СПМ, которые обычно обнаруживаются в исслелуемых объектах, приведены в табл. 46.1. СПМ чаще всего выявляют методом посева на определенные питательные среды. Содержание СПМ оценивают по двум показателям — титру и индексу. Титром называется выраженное в миллилитрах (для твердых тел в граммах) наименьшее количество исследуемого материала, в котором обнаруживаются данные бактерии. Индекаозл называется количество СПМ, обнаруженных в ! л жицкости (! г плотных веществ, 1 м' воздуха).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
