А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 141
Текст из файла (страница 141)
Кроме расплавленной и остуженной до 45 — 50 С основы добавляют 5 мл стерильного обезжиренного молока и бромкрезоловый пурпурный нли мел в количествах, как указано выше. На этой среде Е.ЬтсГи зцЬзр. сгетоп1з, не гидролизующий аргинин, образует желтые колонии, а Е. зцЬзр. 1асФ и А. зиЬзр. Ыисел1асйз — белые. В состав сред для выращивания лактобацилл входят ингредиенты„богатые аминокислотами, витаминами. Добавлиот томатный сок, дрожжевой экстракт или автолизат как источник пуринов н пиримидинов, необходимых для роста.
Среда РС для выделения бактерий рода РасгоЬасйиз и 7асюсосст р!ипгагит содержит (%): пептон — 1,0; ппокозу — 2,0; печеночный экстракт — 1,0; дрожжевой экстракт — 0,2; полисорбат — 0,8; К2НРО« — 0,2; М8804 — 0,2; Мп80«вЂ” 0,05; триаммониевый нитрат — 0„2; апетат натрия — 0,5; твин-80 — 0,01. Среду разливают в стерильные пробирки и стерилизуют при 1 атм в течение 15 мин. Устанавливают рН 6,2. Для повышения селективности в среду перед зассвом добавляют 1 мл 0,4%-го щелочного раствора сорбиновой кислоты.
Испьггусмый материал засевают вначале в жидкую среду, а затем наслаивают на нес «голодный агар» (столбик высотой до 2 см) для создания анаэробных условий, инкубируют в течение 5 сут при 30 С или 3 сут 37 'С. При наличии мути и газообразования инокулят высевают на агаризованную среду этого же состава, инкубнруют при заданной температуре и производя г подсчет лактобацилл через 48 ч. Для создания анаэробных условий на застывшую в чашках Петри среду с инокулятом наливают второй слой расплавленной и остуженной голодной агаровой среды в количестве 5 см'.
Для выделения бактерий рода В"Г)поЬасгепигл используют хукурузо-лактозную среду. Для приготовления среды берут 25 г агара из расчета на 1 л, расплавляют его в небольшом количестве воды, а к остальному количеству дистиллированной воды добавляют 10 г понтона; 40 мл водного раствора кукурузного экстракта, разбавленного в соотношении 1:1; б,б г натрия лимоннокислого трсхзамещенного; О,! 2 г М8804,' 2 г КзНРО« Смесь нагреваютдо 80 С и соединяют с расплавленным агаром, затем добавляют 1О г лактозы, 0,15 г цистеина солянокислого и 0,5 г аскорбиновой кислоты.
Предварительно цистсин растворяют в неболыпом количестве дистиллированной воды и устанавливают рН 8,45 раствором гидроокиси натрия. Всю смесь доводят до 1 л водой и устанавливают рН среды 7,0. Среду разливают в пробирки высоким столбиком по 10 мл и стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин. Исследуемый образец разводят в физиологическом растворе, нейтрализуют 10%-м раствором гидрокарбоната натрия и засевают из серии разведений в пробирки со средой, предварительно прокипяченной в течение 15 мин для снижения в ней содержания растворенного кислорода. В момент посева температура среды должна быть 38 С.
Пробирки с посевами инкубируют при 37 'С в течение 72 ч, но просматривают посевы и через 24 — 48 ч. По окончании учитывают колонии, вырос~цие в последних разведениях, где выросли типичные колонии для бифидобакгерий — в виде «гвоздиков», «вытянутых всретен», иногда в виде «полос», расположенных вдоль пробирки.
На плотных средах колонии имеют вид «дисков» или «грсчипшых зерен». Выросшие колонии подсчитывают с учетом разведения. 474 Для культивирования бактерий рода ВДй(одас(ег(ит известна также среда, приготовленная на водопроводной воде, содержащая гг/л): гидролизат казеина — 10,0; мясной экстракт — 5,0; дрожжевой экстракт — 5,0; глюкоза — 10,0; КзНР΄— 3,0; твин-80 — 1,0 мл, рН 6,8. После стерилизации при 0,5 атм в среду добавляют 1,0 % аскорбата натрия и 0,05 % цистеина солянокислого.
Принадлежность каждой отобранной колонии к определенным микроорганизмам определяют по отношению к окраске по Граму, по подвижности и другим морфологическим признакам. Культуры, образуюц1ие псевдокаталазу, относят к Рег((ососсив, как микроорганизмы, не имеющие цитохромов„но дающие положительную реакцию с бензидином.
При идентификации бактерий рода 1еисопов(ос препарат окрашивают по Бурри для выявления капсул. Отсутствие роста в МПБ при рН 9„6 и с 6,5%-м ХаС1 характерно для лактококков и Ятер(оеоссив (пегтор(н(ик Причем, инкубируя последние на питательной среде при 45 С в течение 3 сут, можно отделить мезофильные кокки. После выделения чистую культуру пересевают в обрат и наблюдают характер и время образования молочного сгустка.
Лактококки 1. (асйв звЬзр. (асив образуют плотный сгусток за 6 — 10 ч с максимальной кислотностью 100 — 125 Т; 1.. (ас((в звбзр. сгетопв дает сметанообразный сгусток за это же время; 1.. (асг(в зцбзр. д(аее(((ас(в свертывает молоко за 18 — 48 ч. Активные расы термофильных лактобацилл при оптимальной температуре сбраживают молоко за 10 — 12 ч, причем предельная кислотность достигает 300 — 450 'Т, мезофильные стрептобактерии образуют плотный сгусток через 3 — 5 сут с кислотностью 200 — 250 Т, а газообразующий тип лактобацилл не образует сгустка.
Молочнокислые бактерии синтезируют различные ингибиторныс вещества, например: кислоты, ацетон, перекиси, а также низкомолекулярные антимикробные белки — бактериоцины, которые подавляют рост сопутствующей микрофлоры. 44.4. ОБРАЗОВАНИЕ БАКТЕРИОЦИНОВ МОЛОЧНОКИСЛЫМИ БАКТЕРИЯМИ Бактериоцины составляют болывое семсйспю полипептидов, которые подразделяют на различные классы, основываясь на их действии и их структуре. Все бактериоцины по биохимической природе являются белками.
В пользу этого предположения свидетельствует тот факт, что большинство антибактериальных веществ, относящихся к бактериоцинам, разрушаются протеолитическими ферментами, но у разных бактериоцинов чувствительность к протеазам варьирует. Некоторые бактериоцины резистентны к действию протеаз. Устойчивые к протеазам бактериоцины, например низин и лактииин 481, образуемые 1.. (ас((в зцЬзр.
(асив., характеризуются наличием в их молекулах сульфидных колец, которые содержат мезо-лантионин и р-метиллантионин, а также необычные аминокислоты — дегидромасляную и Р-дегидроаланин. Бактериоцины имеют молекулярный вес от 3 до 10 кДа. Белок бактериоцина связан с липополисахаридом клеточной оболочки, но именно белковая часть комплекса обладает антибактериальной активностью. Эти факты указывают на наличие в клетках определенных механизмов, регулирующих функции бактериоциногенных факторов.
Биосинтез бактериоцинов — наследственная 475 особенность организмов, проявляющаяся в том, что каждый штамм способен образовывать один или несколько определенных, строго специфичных для него антибиотических веществ. К числу общих свойств бактериоцинов относится их чувствительность к температурным воздействиям, хотя это свойство также варьирует в широких пределах. Одни из них разрушаются уже при температуре 48 — 50 С, другие кратковременно выдерживают температуру б0 — 70 'С, а отдельные сохраняют активность даже при 100 С, например, низин выдерживает кипячение до 120 С без потери активности.
Существуют различные способы выявления антибиотических свойств микроорганизмов. Многие из них основаны на способности антибнотических веществ лиффунлировать в плотные агаризованные среды и образовывать зоны подавления роста тест- организма. Величина зоны отсутствия роста указывает на степень активности данного антибиотического вещества в отношении исследуемой тест-культуры и зависит от его концентрации и химической природы. За единицу активности бактерноцина низина принимают такое его количество, которое подавляет рост Блергооюслг ада!асг!ае (стрептококка группы В, присутствующего в желудочно-кишечном тракте) в 1 мл питательного бульона за 16 ч инкубирования, учитывая, что 1 мг чистого низина содержит 40 ООО международных елиниц (МЕ).
Низинобразующую активность опрелеляют микробиологическим методом с тест- культурой 8ас!!!ил свали!агм — термофильной споровой кислотоустойчивой бактерией, когорую выращивают в агаровой среде, приготовленной на бульоне Хоттилгерл с добавлением (г/л): 14аС! — 2,0; агар — 20,0; пептон — !О,О; глюкоза — 10,0. Станлартом служат растворы очищенного коммерческого препарата !')!зар!!и («Арр!!и "к Ваггеп, 1 !д.», Великобритания) с акпзвностью 5, 10, 15, 20, 40 МЕ/мл. Для титрования бактериоцина используют суспензию 17-часовой культуры бациллы с оптической плотностью 0,7 (цри л =- 540 нм, оптический путь 0,5 см), которой засевают среду, приготовленную на фосфатнож буфере (рН 5,0) и содержащую (г/л): пептон — 20,0; глюкозу— 10,0; агар — 20,0.
Эксгракцию антибиотика из культуральной жидкости и стандартных растворов проводят смесью ацетон: уксусная кислота: вода (4: 1: 5) при 55 С в течение 90 мин. Экстракты разводят фосфатным буфером (рН 5,0) в соотношении 1: 1О и вносят в лунки на агаровой среде с тест-организмом, затем инкубируют при 55 'С в течение 17 ч. Количественное определение антнбиотической активности проводят по измерению зон подавления роста В. свали!алз с дальнейшим пересчетом по калибровочной кривой стандартных растворов низина.
Хранение молочнокислых бактерий Традиционные методы поддержания культур молочнокисяых бактерий сводятся к их выращиванию на богатых питательных средах с частыми пересевами. Электнвной средой является обезжиренное молоко (обрат). Бактерии, выращенные в обрате, хранят в виде молочного сгустка в течение месяца. Однако частые периодические пересевы ведут к снижению выживаемости бактерий, изменению состава популяции, потере ряда физиолого-биоюзмических свойств. Гетероферментативиые молочнокислые бактерии могут утратить способность к образованию летучих кислот, спирта и СО, и перейти на гомоферментативный пугь сбраживанпя гексоз. Известны способы хранения культур, выращенных на специфических лля бактерий средах, в 25%-м растворе глицерина илн под слоем вазелинового масла при — 20 С, в лнофильном состоянии, высушенных с использованием защитных сред в качестве криоцротекторов, нзменякш!их осмотнческое лавление в среде и снижающих величину активности воды.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
