Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_1 (1123309), страница 29
Текст из файла (страница 29)
Пары веществ проходят через колонку, увлекаемые равномерным потоком инертного газа, например аргона, гелия или азота. Компоненты смеси движутся по колонке с различными скоростямн в зависимости от коэффициентов распределения между газом (подвижная фаза) и нелетучей жидкостью (неподвижная фаза), Наличие разделяемых веществ в потоке газа, выходящего из колонки, обычно обнаруживается физическими или химическими средствами. Результатм автоматически записываются на диаграммной ленте в виде серии пиков.
Площаль каждого пика пропорциональна концентрация соответствующего компонента смеси. Идентификация компонентов на хроматограмме осуществляется с помощью стандартов. Проведенное таким образом разделение смеси метнловых эфиров жирных кислот представлено на рис. 535. Для идентификации членов гомологнческого ряла, например метиловых эфиров насыщенных жирных кислот с неразаетвленной цепью, строят график зависимости времени, необходимого для элюирования дапнога соединения (вре»ени удерживания), от числа атомов углерода в молекуле, Газожидкостная хроматография позволяет проводить количественное разделение н анализ наиограммовых количеств смесей многих веществ. 5.6.3.3.
Иоиообменнаи хроматография В этом каскадном методе раствор, содержащий смесь ионов, наносится на колонку с подходюцпм нерастворимым носвтелем, несупгнм фиксированные заря кенные группы и находящимся в равновесии с водным буферным раствором. 351см через колонку под действием гидростатпческого давления (движущая сила) пропускается буферный раствор. Разделение происходит вследствие наниых взаимодействий (залержнваюпгая сила) между растворенны»н вешествамн н носителем.
Движение ионов вниз по колонке опрелеляется природой носители, свойствамн разделяемых ионов и растворителя. Прн»еняются несколько типов носителей (ионитов), включая синтетические Емолы, целлюлозу, декстран или атарову, в которые введены катнонные нли !. ОСНОПНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ анионные группы. Смолы, связывающие катионы„наэываютси кагиолообменными нлн кагорлигпми, а связывающие анионы- -алйолообмеллыми нлн пнионигами. В табл, 5.4 перечислены некоторые типичные нониты, производимые промышленностью, Таблица 54 Некоторые широко применяемые ноииты Аппоепг Клгпоонг Нолпнергои! ~ Фупкапонольпаа ооснгсль группе Полая ер пня еоспгсль — %(сн,— сн,), Сульфирован- ный полистирол с поперечными связями Полиметакри- ловая кислота с поперечными связями Триэтиламино- полнстирол с поперечнымн связями —.
((Сн„), ! СН,— ОН вЂ” СООН д ( метил)амино- полистнрол с поперечными связями — (сн,),— н ~чСсНН,— СН (СНе)е Х(СН~ Снз)з Ь~ ОН Фосфсцеллюлоза -Π— РОеН диэтиламино- эгнлцеллюлоза дизгил(2-окси- пропил)амн- ноэтилендек- стран Карбоксиметнл- целлюлоза — СН -СООН вЂ” (СНе) л — ЬОеН Сульфопропнл- декстраи Принцип ионного обмена иллюстрирует схеьга на рис. 5.15, где рассмотрено взаямодействие двух гипотетических веществ РН+ и ЯН+ с катионнтом, содержащим функциональные сульфогруппы.
Прежде всего копит промывают большим объемом буферного раствора, содержащего равные концентрации слабой кислоты НВ (рК=4) н ее иатрневой соли (!па+В-), причем рН раствора равен 4, а концентрация ионов (та+ О,1 моль/л. Полученную таким способом смолу (в )ча-форме) переносят в колонку в том же буфере (рН 4). Вешествв РН+ и Он+ являются слабыми кислотами; каждое из нешеств имеет одну кислотную группу (РКр б и РКч=у), Если РН+ н ЯН+ растворить в небольшом объеме буфера с рН 4 и нанести на колонку, уравновешенную тем же буфером, то РН+ и ОН+ будут замещать ионы натрия на катионите.
После завершения этого процесса РН+ и ОН+ окажутся в неподвижной фазе, т. е. на нерастворимом катиоиите. Рн+ и ЯН+ очень прочно связываются с катионитом в данных условинх (рН 4 и (!та+) =0.1 моль/л). Связывание ыожет быть ослаблено изменением концентрации Ха+ или рН раствора. Если буферный раствор подщелачивать до рН 5, соединение РН' начнет частично диссоциировать, образуя Р, которое плохо связывается с обменником. При еще более щелочных рН будет ображиываться О, также плохо связывающееся с носителем. Напротив, если значительно увеличить концентрацию Ха+, например от 0,1 до 0,5 моль/л.
поддерживая рН 4, то как РН+, так и ЯН+ будут менее прочно связываться со смолой. поскольку большее число ионов )цаг окажется способным конкуриро- 5. БЕЛКИ. И о о + е + о е + а е" е ! ° 2 (())не (р)не ичеиие иеицеимаа- ееии Рнс. 5.16. Принципиальные особенности ионного обмена. Частица катионообменной смолы изображена в виде большой окружности. а — смола имеет фиксированные отрицательные заряды и находится в Ма+-форме, Ноны На+ (1), связанные со смолой, быстро обмениваются с катионами натрневой соли (2) слабой кислоты НВ (3); б — соединения РН+ (4) и ЯН+ (б), добавленные в систему, обмени* ваются с ионами натрия н оказываются связанными со смолой; и — сродство РН+ к смоле снижено увеличением рН до 6, т. е. до рК РН+; г — сродство РН+ и ОНе к смоле ослабляется также при увеличении концентрации )еа+.
о + о е- + о °- б е+ о ° е+о + + Се) е~ а+ ЕЕ ПЕ + °- ° - й о з Ппн" е (а)н' г о до ~Ф~, ф~ ке)О о ерЪ !. ОСНОВНЫЕ КОХ1ПОНЕНТЫ КлС ГКН 34 Вв УВ зю 4ю 4В 4В '4В 4В % В 44 йй. ь)В! ы — жл ж ~яяьпг э— чмваэ эаэээл Рис. 5.!7. Латочатическзя запись результатов хроматографического анализа стандартной смеси аминокислот на сульфированной полистнрольной смоле. [Зрасй- тпп )!. )т'., 51е!и Мг. Н., Мопсе 3., Апа! Сйегп..
30, П90, 1958.) вать за сульфогруппы смолы. Следовательно, для то1о, чтобы разделить Р и О в этой систече, нужно приготовить буфер с такими рН н концентрацией Ха+, чтобы РНэ и ОНг имели различное сродство к понизу, то~да прп пропускании смеси РН+ и Цг!э через колонку проиаойдет разделение. Другие факторы, такие, как температура и присутствие органических растворителей. также влияют на хроматографическое поведение смесей ионных соединений. Очевидно, что подобный механизм процесса иояного обмена имеет место н на анионитах; только в этом случае фиксированные кагноиные группы носителя связывают.
аниопы. Ионообчениая хроматография широко используется дзи разделения биомолекул. Примером, свидетельствующим о ее высокой разрешаюшей способности. является приведенная на рис 5 17 картина разделения аминокислот..')ля разделении требуются дне колонки: одна (150 см) для кислых, нейтральных и ароматических аминокислот, а другая (15 см) для оснбвных аминокислот. Очевидно, что удерживание аминокислот зависит от их основности Поэтому аспарагнновая и глутаминовая кислоты выходят с колонки раньше большинства нейтральных аминокислот и, естественно, значительно опережают выход основных аминокислот.
В этом случае легко могут быть разделены даи е нсйтральныс ачинокислоты, поскольку, несмотря на близкие значения рК, их неполярпые боковые цепи обладают различныч сродством к смоле. В системе, прел. ставленной на рис. 5.!7. ктюат, вылодяший нз колонки, автоматичесш1 смешивается с рве~вором нингидрина; при прохождении аминокислоты с инпгидрином через нагревательную ячейку появляется окрашиванне, интенсивность которого 5. БЕЛКИ. И 155 О,Е ~ — ' 55 цз еЧ О:',2 0.1 . 500 1ООО 1500 2000 2500 5000 5500 40(Ю 0500 Объем елемгпа. мл Рнс. 5.18.
Хроматографнческое разделение смеси белков 305-субъединнцы рнбосомы е. сой (гл. 26). смесь нанесена на колонку (2,82260 см) с фасфоцеллюлозой, уравновешенной фосфатным буфером (рН 6,5), содержащим 6 М мочевину. Затем через колонку со скоростью 45 мл/ч пропущен буферный раствор с линейным градненгом концентрации ХзС1'от 0 до 06 моль/л. Фракции злюата собирались нь 23 автоматически, концентрация белка определялась по поглощению прн л р д ине волны 0 нм (Аэм).
Некоторые пики содержали индивидуальные белки; пики, обозначенные более чем одним номером, представляли собой смеси белков. [Оаг- г(8 8. й 8., Кит!апет' С, 6., Уоупов Р., 72(ооа 6., В!Осйет., 8, 2897, 1967.) определяется фотометрически. Изменение фототока с изменением объема элюата автоматически записывается самописцем иа диаграммной ленте.
Определение площадей пикон позволяет проводить анализ смесей количественно. Идентификация отдельных аминокислот осуществляется довольно просто, поскольку а контродируемых условинх параметры выхода с колонки постоянны для каждой аминокислоты. Все эти принципы были использованы при конструирозаиия ачинокислотных анализаторов. Разделение смеси аминокислот, приведенное на рнс. 5.17, является примером ионообменной хроьщтографии при постоянной концентрации !е!а+ и трех различных значениях рН. Часта оказывается невозможным точно подобрать необходимые условия для удовлетворительного разделения неизвестной смеси ио.
нов. По этой причине во многих случаях разделение на ионите проводят с помощью градиентного элюировання, при котором состав буферного раствора, поступающего в колонку, изменяют постепенно (либо относительно концентрации неорганического иона, участвующего в обмене с функциональными группами смолы, либо относительно рН), что приводит к изменению сродства растворенных веществ к нониту. На рис. 6.18 в качестае примера использования градиентного элюирования приведена картина разделении смеси белков.
6.6.3.4. Гель-проникающая хроматография (гель-фильтрация) ма и о В этом виде хроматографии зещестаа разделяют в соответствии с разы ф рмой их молекул. Если гранулы различных пористых нерастворимых р . Ораматернзлов, таких, как синтетические смолы, пористое стекло или полнсахариды (декстран или агароза), суспендировать а подходящем растаорнтеле, то обз и разуются две фазы растворителя (одна внутри, а другая вне гранул), как по .- а о схематически на рис. 5.19.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
