Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_1 (1123309), страница 33
Текст из файла (страница 33)
(при условии, что все субъединицы одинаковы по размерам). Если же в белке присутствуют субъединицы различных размеров, то проще всего убедиться в этом с помощью электрофореза в геле в присутствии додецилсульфата натрия (разд. 5.1.7). В качестве примера можно привести иммуноглобулнпы, которые содержат субъединицы совершенно разных размеров. В табл. 6.2 приведен ряд белков с известной субъеднннчпой структурой, в ней же даны некоторые их структурные характеристики. Данные по определению молекулярной массы сами по себе недостаточны для того, чтобы решить вопрос об идентичности всех субъединнц данного белка. Нативный гемоглобин имеет молекулярную массу 65000; однако при определении молекулярной массы в денатурнрующих условиях (как в присутствии, так н в отсутствие меркаптоэтанола) получают значение, приблизительно в че- Е ЗАЛКИ, Ш.
О в з 5 х Х О. О О ы О Е ы ы З З х й «' х х С1. О. «« „йй 3й$ с' Я й з щ З С' О х Д ы й О сч О х з с«, й х Ф Ю ос«олооо хоо х Доо ж й « й уз ! ооо ос«ооооо О х д юов л с ххл «~ е <~~~ « «'з о о о «О «.й „ й й «3 а ="" «х оо-О \О СС О вх а в ХО-а" ывх х в хы'~хх х зххф$ О Л ХО О х х О ах О Ох«Ох хх даххХ хЫз лавхц Ох хайда фй аойз з", сз ?с о «с ххз явв З й О ~("М х х «с О в з в О ЬС ж ых Охд дх х $ х О« 'й«х О.
Х«Х хх х х «.ы« вс о О Х х и ы х ОВ О ХЗОХайыХх «.двдввлХ ,с эс Х х в ОООВх~з«« вййыхйзх ~ ~с $ В.Кф $ «х ФЪ « «в ХОД й, с1. >, О, ~р. х х в ы «х ОС ЯИ $ Ю О $ М х х сз с О х О х х «О Х х «- в О «« з ь 3 х х х .З ,« й и х х $ х О к х й' 3 х Х ОХ .«х « ОХ х й Х О ОХ О 7„по « «с в в в ,,«хх ы МввызйЗ« да«с х ОЗ «вОРО« 1 ««'ООйо~ охыя хзх х х х х с ЯО,„ х с« $ о'~ оо оо оь о«. .
м. ФО Ф й р й ( й й й й й Д 1тэ К ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ тырс раза меньшее, что свидетельствует о наличии в гемоглобнне четырех субъединнц примерно одинаковых размеров, не связанных межцепочечнымн дисульфидными мостиками. Зги данные, однако, не дают никакой информации о том, идентичны ли аминокислотные последовательности всех четырех цепей гемоглобина.
различны ли они или же имеется смешанный вариант. Вопрос о том, одинаковы или различны аминокислотные последовательности субъединиц, можно выяснить путем определения числа пептидов в ферментативном гндролизате белка. Наиболее широко используемый для этой цели протеолитический фермент— трипспн, гидролизующий только те пептндпые связи, которые образованы карбоксильными группами лизина или аргинина. По суммарному содержанию лизина и аргинина в белке можно примерно предсказать число триптических пептидов, которые должны образоваться при полном гидролизе трипсином.
Для белка, состоящего из одной полипептндной цепи, число триптических пептидов равно числу остатков лизина и аргинина в молекуле плюс 1. Вдвое меньшее число пептидов образуется из белка, содержащего две субьединицы с одинаковой амннокислотной последовательностью.
Пептиды разделяют иа бумаге или других подходящих носителях (гл. 5), используя обычно электрофорез в одном направлении н хроматографию в другом с последующим обнаружением пептидов по реакции с ниигидрином. Чрезвычайно маловероятно, чтобы два триптических пептида с различной аминокислотной последовательностью обнаружились в виде одного пятна. Более серьезные возможные осложнения обусловлены тем, что значительная часть триптических пептидов оказывается нерастворимой и не проявляется на пептидных картах, как это иногда случается прн исследовании крупных белков.
Обычно же число обнаруживаемых пептидов довольно близко к ожидаемому. Следовательно, метод пептидиых карт в сочетании с определением молекулярной массы достаточен для того, чтобы выяснить, являются ли аминокислотные последовательности субъединиц одинаковыми или различными. Анализ пептидных карт широко применяется при сравнении белков с весьма близкими структурами, отличающимися одним или несколькими остатками. Многие аномальные гемаглобины (гл. 31) отличаются от нормального одним единственным остатком. Пептнд, содержащий такой остаток, обычно проявляет отличную от соответствующего пептида нормального белка электрофоретическую или хроматографическую подвижность (рис. 6 1).
Методы идентификации г)Нмконцевых остатков, обсуждаемые ниже, представляют собой другое мощное средство для выяснения вопроса об идентичности аминокислотных последовательностей полипептидных цепей субъединиц. Неидентичность двух цепей инсулина очевидна (см. табл. 6,2), поскольку на 1 моль инсулина приходится по 1 молю ХНмконцевых глицина и фенилаланина. В про- 1тз Е. БЕЛКИ.
и1. и и н е и й е а ь С ь гемоглоеин л гемоглобин З и б Рис. 6.1. Пептидные карты гсмоглобииов человека. Триптические гидролизаты гемоглобина А и гемоглобина 6 человека были ваиесены в стартовые точки на листах фильтровальной бумаги; аатем был проведен злектрофорез в одном наяривлении и хроматография — в другом. Пептидиые карты гемоглобина А (о) и гемоглобина Ь (б) были проявлены ииигидрииом, Нативиый гемоглобин содержит 56 остатков лизина и аргинина (табл. 6.1). Поскольку на карте обнаруживается только двадцать шесть пептидов, белок, по-видимому, содержит 2 типа пептидных цепей с различиымн аминокислотиыми последовательностями.
Если бы все четыре цепи имели идентияные последовательности, было бы обнаружено 16 пептидов, тогда как, если бы все цепи были различными, можно было бы ожидать образования -60 пептидов. Единственная аминокислота, отличающая гемоглобииы А и 6, находятся в пептиде 4. (бсйгоеоег йт. А.„ТИе Ргппагу 51гпс1пге о1 Рго1шпа, Нагрег 6 моиг, Рпымиег, !псогрога1еб, Хечг Уогй, 1968.] тивоположность этому в глнцеральдегид-З-фосфатдегндроггназе, содержагцей четыре идентичные цепи, определяется 4 моля )ч)Нзконцевого валина на 1 моль белка.
Факт обнаружения одного ХНк. концевого остатка сам по себе, конечно, ие является гарантией идентичности субъединиц; известны примеры, когда в белке имеются цепи с одинаковыми )чНз-концевыми остатками, ио с различными амннокнслотпыми последовательностями, например две различные цепи гемоглобина имеют в качестве ЫНз-концевого остатка валин. 6.1.2.1. Методы гщеитифнкации )ЧНз-концевых остатков Один из методов основан иа использовании реагеита, вааимодействующего с амииогруппами белка и ие удаляющегося при последующем гидролизе. Установлено.
что 2,4-дииитрофторбеизол (ДНФБ) — подходящий реагеит для обнаружения и иидеитификации ННз-концевых остатков. Реагеит взаимодействует с п- и е-амияогруппами с образованием окрашенных в желтый цвет дяиитроФеиизькых пронзводныт (ДНФ-производных), а также с некоторыми другими к основные компог1внты клнткн боковыми группами аминокислот (имидазолы1ой, феиольной, тиольной), образуя„ однако, прн этом неокрашенные ДИФ-производные. Ниже приведена реакция ДНФБ с амипокислотой1 Озн Р Ь НлНСНОООН ~ О,И 1 ННСНСООН+ Ы,Р ыо 2 Реакция с белком проводится в слабощелочной среде, затем избыток реагевтв удаляют и белок гидролизуют в 6 н.
НС1. Окрашенные в желтый цвет ДНФ- аминокислоты экстрагируют неполярвым растворителем. например хлороформом или эфиром, и разделшот хроматографически. Поскольку после экстракцин а-ДНФ-аминокислот в-ДНФ-лизин остается в водной фазе, можно количественно определить содержание е-аминогрупп. Другой химический метод определения ИНз-концевых остатков — цванатныв метод. При обработке пептидов цианатом в слабощелочном растворе образуетсв карбамоильное производное. О 1 11 н НИСО + НзИ вЂ” СНК вЂ” С вЂ” И вЂ” СНК " — ь О ОК ,7 — ьнзИ вЂ” ь.— И вЂ” СНК вЂ” С вЂ” И вЂ” СНКз'" ' 1 ! + +Н,И вЂ” а "- О=С вЂ” "СК Н Нагреванне карбамонльного производного в слабой кислоте приводит к отшеплевию Инз-концевого остатка в виде гндантоина, который может быть легко выделен и после кислотного гидролиза идентифицирован в виде свободной аминокислоты.
Другой подход основан иа использовании реагента, образуюшего с ИНз-концевым остатком производное, которое можно затем отшепить, не гидролизун остальную часть пептидной цепи. С этой целью успешно примеияетсв рвагвмт Эдмапа — феннлизотиоцианат !ФН'П\). К' О НК" О НК"'О 1 11 1 1 11 1 1 11 ьльмл ььлльь СзНз — И=С=в + НзИСНС вЂ” ИСНС вЂ” ИСНС Пмяилимязиацианам Н Б Н К' О НК" О НКь'О 11 1 1 !! 11 ! 11 11 з з — СэН вЂ” И вЂ” С вЂ” И вЂ” СН-С вЂ” ИСНС вЂ” ИСНС... — — ь фенилмизкзбрэмоизнроизводноз 1фтк - рраизвщнсе] пзпззогз !изи белка) С,Н,И вЂ” СВ К" О НК'"О 11! 116 С + НзИСНС вЂ” ИСНС " Феиилмиогидаишоин 1л5 6.
БЕЛКИ. Ш. На первой стадпн образуется ФТК-производное пептида (или белка), которое затем подвергается действию слабой кислоты (стадия 2) при комнатной температуре. При этом отшспляется «ргнилтиогидплтоиловог производное (ФТГ-производное) !41-!л-ко««цевок аминокислоты, а пептяд уиорачнвается на один остаток, Для проведения последовательной деградации по Эдмаву часто использ>ют автоматический дрнбор. При благоприятной ситуации с его помощью мо«кет быть пройдено от 40 до 50 «шагов». Г!осле каждого шага отщеплениый фснилтиогндантонн должен быть идентифицирован с использованием тонкослойной или газожндкостпой хроматографии или подвергнут кислотному гидро- лизу с последующей идентификацией регенернрованной аминокислоты. Чувствительный метод идентификации !ч)4л-концевого остатка основан на применении данснлхлорида (1-димепшамннонафталин-б-сульфонилхлормда).
Благодаря интенсивной флуоресценцин дансильных групп можно обнаружить и определить минимальные количества данснламииокислот. н,с сн, ы н,с сн, н + л инон слоги о-э=-а о=э з нн — к к длнсилос инонислол«л длнсилллср д лссл«ид дзнсиллолл«ил Дансильный метод часто используется в сочетании с деградацией по Эдмаиу. После отшеплення каждого аминокислотного остатка пробу с пегггршом (аликвотную часть) подвергают действию дансилхлорала для выяснения (обычно с помощью тонкослойной хроматографии) природы следующего остатка.
Помимо химических методов определения !)Нз-концевых остатков применяют также ферментативный метол. Используемый пря этом фермент лей«)няпдплолглгидпзп функцконирует прв наличии у пептида свободной концевой и-аминогруппы. Следовательно. ог пецтнда„ имеющего последовательность )4Нз — А.В С 1>..., где А, В, С, !> — различные остатки, под действием втой аминопептидазы будут последовательно отшепляться свободные аминокислоты. В любой момент времени количество отщепленной аминокислоты А больше, чем В, а количество В больше, чем С, и т. д.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
