Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_1 (1123309), страница 30
Текст из файла (страница 30)
Колонка, наполненная такими грануламн, дей- ка- !. ОСНОВНЫЕ КОМНОГ!ЕИТЫ КЛЕТКИ оооо Е » е ь йй е к й » »» Рис. 5,19. Схематическое изображение процесса разделения трех веществ с различными молекулярными массами с помощью гель-фильтрации. Молекулы наименьшего размера могут свободно входить во внутреннее пространство частиц геля; более крупные молекулы также могут войти внутрь частицы, ио не столь легко, как первые. Самые крупные молекулы неспособны проникать внутрь геля. Светлые кружочки — частицы геля. а — смесь нанесена на колонку; б †проце разделения прошел наполовину; в — самые крупные молекулы начинают выходить с колонки; г †крив злюироваиня, полученные путем намерении концентрации вещества в каждой фракции собранного злюата после завершения хроматографии. Если 1'е — объем растворителя между частицами геля, а У, — объем доступного растворителя внутри геля, то объем злюирования У, (объем, с которым данное вещество выходит с колонки) равен У = У»+КУ» (К вЂ” козффициент распределения вещества между подвижной фазой Уо и неподвижной фазой У,).
Для веществ, не способных проникать в гель, У, У». поскольку длн них К =О. Для веществ, способных входить в гель, У»>У»! У =У»+У» для молекул. свободно проникающих в гель (К 1). 157 з. велки. ы 1,0 е це з с й ца м И цг аз 0,2 ' 0 10 ао зо 40 50 60 70 60 номер чзяконе Рнс. 5.20. Гель-фильтрация смеси олнгосахаридов И-ацетилглюкозамнна.
Смесь олнгосахзрндов в 0,1 М г1аС! накесена на колонку; скорость злюнровання 600 мл/ч. Объем каждой фракция 125 мл. Римские цифры у ников указывают число остатков И-ацетнлглюкозамвна в соответствующем углеводе (напрнмер, !в Х-ацетилглюкозамин, Ч1 — хнтогексоза~. !ВауГегу М. А., 1тапе1-М 0игзг Е.
1Р., Рагзояз 3. М., Воп1егз С., Уго1соы В, 6., Вегаяей Уг.,!00 7, Апа!. Вюсййш., 30, 429, 1969.1 ствуст ьак молекулярное сита, поскольку молекулы небольших размеров распределщотся между обеимн фазами, то~да как более крупные молекулы не могут проникнуть во внутреннюю фазу. Гранулнрованный материал можно под- хи. нческой обработке с целью получения определенной пористостн и, таким образом, приблнзнтсльно определять молекулярные массы веществ, , способньж проникать внутрь гранул носителей. Б табл.
5.5 приведены некоторые шнроко применяемые в гель-проникающей хроматография молекулярные сита с указаннем оптимальной области молекулярных масс. Ес кол пку с носителем, размеры пор которого исключают пронякно- лина ' о венке во внутреннюю фазу веществ с молекулярной массой выше з д а анной, нанести смесь растворенных веществ с разлвчнымя молекулярными массами, то вещества с размерами молекул меньше заданного пронинают во внутреннюю 1. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ Таблица Б.Б Некоторые носнтелн, применяемые прн гель-фнльтрацнн Молекулярные массы нещести. неепти:обиых приникать яо ннутреинюы фазу носителя Тип носителя )700 )1 500 1 000 — 5 000 . 1500 — 30000 4 000 — ! л О 000 5 ООΠ— 400 000 ! 10з — 4.10в 5,10з 20 10в 20.10в — 4О 1О"' Декстран Агароза фазу н отделяются от более высокомолекулярных !см.
рнс. 5.19). Некоторыс вещества с незначительно отличающимися молекулярными массамн могут быть ле~ко отделены друг от друга; например, моно-, дн- н трнсахарнды легко отделнются от более высокомолекулярных олкгосахарндов, как показано на рнс. 5.20. Понятно, что способность молекулы проникать во внутреннюю фазу эавнснт как от молекулярной массы, так н от формы молекулы, а в случае макромолекул форма часто оказывает такое же существенное влияние на реальный объем удержнвання, как в нх размер. Аснмметрнчные молекулы могут оказаться неспособнымн проникать во внутреннюю фазу, легко доступную сфернческнм молекулам такого же размера, н поэтому мокнут злюнроваться с колонки меньшим объемом, чем сферические молекулы.
5.6.3.3. Аффннная хроматографня М вЂ” 1.+Р яр==в М вЂ” 1. ° Р Если лааная смесь не содержнт других белков, свособных связываться с нммобнлнзоввпным лнгандом, то все белки, кроме Р, пройдут вниз по колонке не задержяваясь. После тщательной промывки колонки связанный белок элюнруют раствором, вызывающим днссоцнацню специфического комплекса, т. е.
сдвигают равновесие в прнведенной выше реакцнн влево. Хнмттческаа природа лнганда зависит от природы выделяемого белка н способа занреплення лнганда на носнтсле. Если разделятот смесь ферментов, то лиганд должен быть структурно подобен лабо субсгратам, либо продуктам Аффнннан хроматография нспользуетсп для выдслення таких белков, как ферменты, нммуноглобулвны, лектнны, рецепторные белки, которые обладают способностью спецнфнческв связываться с дрултмн веществами. Несмотря на то что этот метод разработав сравнительно недавно, он уже оказал мощное влнянне ва развитие методологнв очистки белнов. Принцип метода состоит в следующем: лкганд Е, который обладает способностью спецнфвческн связыватьсн с выделяемым белком, прочно закрепляют на нерастворямом носвтвле М.
Полученный таким образом адсорбент МЕ суспенднруют в подходящем растворителе н переносят в хроматографнческую колонку. Затем через колонку пропускают смесь, содержашую выделяемый белок. белок Р связывается со спсцнфнческнм адсорбентом благодаря нековалснтным взанмодействнямт з. Белки.
и ОНОН О вЂ” Сс-Ы ~М~ ~,„=Я +Н,О+В»- ОН С вЂ” Бг ОН й Й атарова См( о~ ~ — См ~~с=.нн а«визированная агароэа чйктивзрованная агароза» затем взаимодействует с ачпнамн: СХ.:— О О м с=НИ+И н — к м с=-н — к+ нн з ХН О О вЂ” С вЂ” НН вЂ” К См1 с=нн + н,н — к См( О ОН (4) ~К Н вЂ” Н вЂ” К О о — с — он о — с=о м с=н — к+н,о ~м + ®' О Огг ОН Были также разработаны другие методы привязывания лигандов к различного типа матрицам, но активация атаровы бромцианом с последующим присоединением аминов остается наиболее широко используемым и гибким методом приготовлении специфических адсорбентов для аффинной хроматографии. Агарозы с принязанными лигандами довольно стай~иены и обладают отличиьгми характеристнкамн как носители для колоночнои хроматографии, Поэтому, если у специфического лиганда отсутствуег амнкогруппа, то ее вводят искусственно.
Поскольку белки содержат свободные аминогруппы, онн легко привяэыва- ферментатнвной реакции. либо конкурентным ингибиторам, поскольку специфичность связывания в атон случае обеспечивается эа счет взаимодействия лиганда с активным центром фермента. Для антитеза лнганд должен быть структурно родственным его антигену, для лектинов — специфическим сахарам, а для рецепторных белков — -рецептнруемым веществам. Основная проблема в создании подходящего ли~аида заключается в необходимости его закрепления на носителе химическим способом, поэтому до тех пор, пока не были разработаны общие методы апривязывания» лагаядов к декстрапам н агарозам, аффянная хроматография не имела практического значения. Прн щелочных рн бромциан реагнрует с декстрананн и агарозами, обычно нспочьзуемыми для гель-фильтрации, а обраэуюшнеся производные ковалентно связываются с первичнымн и вторичными аминами.
Считается, что реакция бромциана со свободными гидроксидныни труппами агароз происходит следующим образом (М вЂ” гранулы атаровы): 1. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ 160 Амз з,о Рис. 5.2!. Выделение химотрнпсина н трипсина из сока поджелудочной железы путем одностадийного специфического связывания с ипгнбитором обоих ферментов. Фракция ХК. вышедшая с колонки после элюирования раствором с рН 3, не содержала на трнпсина, ни химотрипснва и представляла собой белки, неспецифически связанные с помощью ионных взаимодействий с иигибитором иа соевых бобов.
Такое связывание часто имеет место при аффннной хроматографии, поскольку многие лиганды имеют ионную природу и аффинные адсорбенты ведут себя как ионообменники. Таким образом, специфическое элюирование ннгнбиторами дает более высокоочнщснные ферменты, чем неспецифическая десорбция путем нзмененвя ионной силы или рН. !Рога!й б., Кг!з!!аллея Т., рр.
95 †1, !и: Н. г!епга!й, й. Ь. Н1!1, ебз.. Рго!е!пз. чо1. 1, Асабшп)с Ргещ, 1пс., )!етч Уог1с, !975.! ются к зктивированной атарове. Кгароза, к которой привязан белок — шшнбитор трвпснна, выделяемый из соевых бобов, является превосходным специфическим адсорбентом трипсина и химотрипснна !рис.
52!). Оба фермента связываются с этнч ингибнтором в соке поджелудочной;кслезы в условиях нх каталнтической активности, поэтому очень вероязно, что вааимодействие с ннгвбнтором происходит специфически. В аффинной хроматографии адсорбцию белков обычно осуществляют в условиях, благоприятствую1цих максимальнол1у специфическому связыванию. После того как большинство белков сока поджелудочной железы выйдет, не задерживаясь, из колонки, химотрипсин специфически эл1онруют буферным раствором, содержащим ингибитор этого фермента — триптамнн.
Затем раствором, содержащим бензамидин (ингибитор трипсина, но не химотрипсина), элюнруют трнпсин. Триптамин я бензамидин являются специфическими десорбентаыи этих ферментов, поскольку онн также связываются с их активными центрамн и, следовательяо, способны вытеснять оттуда соевый ингнбитор трипсина. Привязывание белков к атарове нашло широкое применение для выделения других белков; например, специфические антитела на какой-либо белок-антиген адсорбируют на агарозе с привязанным антнгеном, а затем де. сорбнруют их, промывая колонку раствором с высокой ионной силой или низким рН.
В настоящее время более чем для !00 ферментов уже получены специфические адсорбенты, представляющие собой ковалснтно пришитые к агарозе синтетические низкомолекулярные ингибиторы или субстраты. Например, гексаноламинные производные ТЗРР и йбацетилглюкозамина, структуры когорых приведены ниже, способны связываться с агарозой, активнрованной бромпианом, э.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
