Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_1 (1123309), страница 27
Текст из файла (страница 27)
За исключением ряда липндов и некоторых других веществ, большинство веществ биологического происхождения плохо растворяется в органических растворителях, и, следовательно, их очистка должна производиться в водных растворах. Кроме того, в каждом классе биомолекул имеется много подобных друг другу соединений, отличающихся очень незначительно.
Например, глицин является одной из 20 аминокислот, обнаруженных в белковых гидролизатах, н его основные свойства подобны свойствам других а-аминокислот. Поэтому были разработаны селективные методы высокого разрешения, применимые для разделенна мнкроколнчеств вешеств. Этн же методы во мноп1х случаях используются в весьма чувствительных н количественньж аналип1ческих тестах, а также для установления чистоты вешества. 5.6.1. Принципы и классификация методов очистки Методы, разработанные для разделения биологически активных веществ, во многих отношениях очень сходны между собой и могут рассматриваться как составляющие единого каскада.
Характерным свойством каскадного процесса является прохождение смеси веществ через ряд последовательных стадий очистки. Проведя одну стадию очистки, можно добиться лишь частичного разделения составных частей смеси; по мере того как смесь подвергается дальнейшему разделеншо с использованием сотен, а иногда н тысяч различных стадий, отдельные ее компоненты выделяются и тем самым достигается высокая степень нх очистки. Изменении, происходящие от стадии к стадии при разделении смеси с помощью каскадного метода очистки, схематически показаны на рнс. 5.10. Можно предположить, что молекулы разделяемых веществ в смеси движутся по каналу, диаметр которого мал по сравнению с его длиной; пространство в канале, не занятое этими молекулами, заполнено растворителем.
Молекулы вешеств в смеси подвергаются действию силы Гн вызываюшей их движение по каналу н действующей одинаково па каждую молекулу; однако другая сила Ет действует в противоположном направлении н задерживает молекулы. Если силы торможения для разных молекул в смеси различны, то прн прохождении по достаточно длянному каналу начинается их а. Белки. г! Время-0 Время т Время =О Время х Рис. 5.!О. Принцип каскадно~о метода разделения смеси веществ.
Раствор двух веществ Л (темные кружочки) и В (светлые кружочки) помещен в специальный капал, площадь сечения которого мала по сравнению с его длиной. Если смесь движешься вдаль канала под влиянкем постоянной силы гь действующей па А и В одинакова, то скорости движения компонентов равны н разделения, как такового, нс происходит (а). Если же задерживающая сила йе неодинаково действует па А и В, то при движении вдаль канала вещество А отделяется от В (б). Скорость движения компонентов А н В зависит от ЬР"=га — Рл и Ьрв=рн. гй соответ- 1 ч ! 2 отвеина, паэтоиу достигаемое разделеяие определяется соотношением Ьг"(Ьрв. Поскольку вещества А н В находятся под действием постоянных сил, то их разделение будет все более полным по мере прохождения вдоль канала, и наконец, па истечении времени йх достигается поппое их разделение (о).
Произвольно малую ллину капала можно рассматривать как одну стадию процесса разделения, а весь канал †- как серик! с~адий. Таким образом, вещества А и В подверга!отса каскад- ному методу рааделения. 1. Оснопн!яе компоненты клетки 144 разделение. Продолжая этот процесс, можно добиться полного разделения компонентов смеси. Как угодно малую длину канала можно рассматривать в качестве отдельной стадии каскадного процесса. В табл. 5.3 перечислены некоторые обычные каскадные методы разделения смесей биохимических вешеств, а также проведена классификация каждого метода на основании природы движущей и задерживающей сил, действуюн!их при разделении. Методы ультрацеитрифугировання, описанные выше, также принадлежат к каскадным методам.
5.6.2. Противоточное распределение Разберем а качсстэе примера типичного каскадного метода разделения процесс протизоточнога распределения. Этот метод заключается з поэтаряемам распределении смеси растворенных зещесгя между двумя несмешиаающимися растаорителями э серии пробирок или делктельных воронок, а которых иесмсшиэающиеся фазы находятся э контакте. Для иллюстрации использования этого метода рассмотрим поведение растворенного вещества при паследоэзтельном распределении между двумя несмешизэюшимнся жидкостями з нескольких делительных коронках. Распределение вещества между двумя несмешизаю<цимися растэорителями определяется его коэффициентом распределения Кр.
концентрация вещества а верхней фазе концентрация вещества з нижней фазе При Кг=! после растворения вещества э любом из двух растворителей н после тщательного перемешиаания фаз количсстзо вещества а верхней и нижней фазах будет адинакозым (при условии, что объемы фаз адянакозы). При последаяательиам переносе вещества з следующие делнтельяые воронки с соблюдением принципа протияотока (рис. б.11) будет лоопа.аться покое распределение между верхней и нижней фазами я каждой воронке. В этом процессе нижняя фаза остается неподзижной и потому так и называется неподвижной фазой, тогда как эерхияя переносится и назыаается подлиз<лай фазой, По эазершеяян определенного числа перенесся вещество будет распределено па ряду пробирок а зависимости от его коэффициента распределения и числа переносов.
Таким образом, при 100ч<рзтном переносе аешестэа с коэффициентам распределения 1 максимальное количество этого эешестза будет сконпсктрироэапо э 50-й пробирке. эсе более уменьшаясь а обе стороны от этой пробирки, так что реальное распределение этого аещестэа будет соотэетстзапэть распределению Пуассона. как показано на рис. 5.11, б. Вешестяа с Кр( 1 будут распределяться э пробирках ! — 60, а эещестза с Кэ>! — з пробирках 50 †1. Каждая пробирка э приборе для протизотачного распределения может рассматризаться как отдельная стадия каскадного процесса разделения, э котором растпоренпые вещества переносятся от одной стадии к дру~ой механически (дэижущая сила Р<) и эадержиааются э заэисимости от их козффициеитоп распределения (задержизающая сила Рз).
Даа соединения с различными коэффипиентамн распределения могут быть разделены после достаточного числа переиосоз, причем число таких переносов зазнсит от абсолютной разности козффициептоа распределения. Для разделенна яещестя с иезиачнтелька отлича<а<цимися коэффициентами распределения (например, 0,05 и 0,1) потребуется гораздо больше переносов, чем для разделения веществ с большей разностью К„. В настоящее время пратизоточное распределение широко применяется а биохимии, хата и не яаляется сталь общепринятым, кзк другие каскадные ме- Б.
БЕЛКИ. И 145 Я х о х у К о. Ю х й о. ох х с л и ко о т ок х- аИ о с ф о и «с аф йс о о сй о й т х о х Б о с о й о сй \ о »т К о х йс со о. е сй ~Д х сЕ с х ф о сй хй х х ф х о ° й х х й Й И о Ю с со и 4 сй о с3 х о. йс ф Ц йс ах. о сй аа хо .9 а З с ох Ы аИ ох дх й «Л сй о.р ох хо О х Й й хо й «1 с ао Ю,М ф ф о ."й Ф ф х В'о ° сх о х Я о. о.ф Х Й о о о ж ко Я К с Ыт аф Ю ок х х о й о йс х о о. хф 1- ф х х х Ю ° й ф о, ф о ф о й Ю % сй $ хх ф х 6 сй х И-1! 48 Р ф х И х Ю о к ф Ю х й ко и ф ок х и йс а". ох а5 с. х х х К~ ф й ии 3:( д о х х Зх кх ох о й ф сй о ,.~ т" а сй а с ф о о о о.
-о с„сс о «1 от х Ю о ф я йс ах м с" х в сй ах сй Кто С.3 с с- х х о К о, сс оф х ! а с- х т х йс й о,ф ф йс К.ф о Иж Я сй хх й с: ф о р о. хо с.«а К з х сф« со от ох с 'х' х х о с„х их о х сй о. ф ой 'с Я о. ф х х х хИ К хл ох ф х ф а хх ох ах х йй ы ххх х х х о. х а о,х ф юИ К ох НИ. о х ф ~х х ф$ ох Л-а т сй Оа сй х ф х х о. й о ф х с. й" й,, сс оо ф о .с о х ха х фо сл о йй ф ":( о о х с х «с ю сс ц ф ф хк х т о ~,о. хо х йй о й й' ф ф с.й ао йс о.
с" ф о о. х х о а о о, ро о. ф х Ко ю йо Б' О ! г З 4 5 Ь 7 З В 7 6 5 4 3 2 1 О О 1 2 3 4 5 6 7 В 8 7 5 5 4 3 2 ! О О 1 2 3 4 5 б 7 6 8 7 б 5 4 Э 2 1 О О 1 2 3 4 5 6 7 В 8 7 б 5 4 3 2 1 О О 1 2 3 4 5 ь, 7 6 В 7 6 5 4 3 2 ! О Кпб О ! г З 4 5 Ь 7 8 8 7 6 5 4 3 2 ! О И>7 О 1 2 3 4 5 6 7 В З 7 6 5 4 3 2 1 О Р 1 2 3 4 5 6 7 8 8 7 Ь 5 4 3 2 1 О общее папипесп>ьп о ! 2 3 4 5 ь г а рапмапреиНсгп ае- щеещеа и прОбирке = О,ЗВ 3 11 22 27,4 22 11 3 О,ЗВ а Рнс. 5.11.
Протнвоточное распределенне вещества с !>р !,О между равными объемами двух несмсшнва!ощнхся жидкостей. а — первая стадпя: 100 мг вещества помощь!От в пробнрку № 0; фазы псремешнвают н оставляют до полного разделення. Поскольку Кп 1, то в обенх фазах будет по 50 мг вещества. Вторая стадия (первый перенос в системе с протнвотоком): верхняя фаза лробнркн № О, содержащая 5!О мг ве!пества, переносятся в пробнрку № 1 со свежей внжпей фазой, а ннжняя фаза пробнркв № О яереноснтся в прабнрку со свежей верхней фазой. Фазы снова оеремешнваются н отстанваются до раэделення.
Кан!дая вврхняя н ннжпяя фазы на этой стаднн содержат 25 мг вещества. Старнн 3--9 осущест- вляются аналогачным образом. В. БПЛКИ. 11 ВОО йд ~ х20 д од Ед од до од од ад гоо д д ад м д о 1 2 3 4 5 б 7 В номе оз б з 6' Рис. 5.11 (продолжение). б — конечное суммарное количество вещества в каж- дой пробирке (в перхней и нижней фазах). годы. Тем ие менее по сравнению с другимн каскадными методами зтот метод наиболее зффективен для разделения граммовых количеств веществ. Кроме того. в продаже имеются установки, содержащие от 50 до 2000 ячеек, в которых каждый перенос пробы осуществляется автоматически. На рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
