Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_1 (1123309), страница 28
Текст из файла (страница 28)
5.12 представлены результаты разделения этим методом смеси органических кислот. 5.6.3. Хроматография Термин «хроматография» в настоящее время применяется для обозначения любого метода разделения, заключающегося в пропусканни смеси растворенных веществ через пористый твердый носитель, независимо от природы сил, способствующих разделению (рис. 5.13). Ввиду того, что используется очень много разиообразпых хромагографкческях методов, стоит рассмотреть принципиальную основу кюкдого метода в отдельности.
5.6.3.1. Лдсорбциоииая хроматография Разделение смесей цветных пигментов растительного происхождения на различных твердых адсорбентах впервые описано в 1003 г. Обнаружена, что застракты зеленых листьев содержат двз зеленых пигмента (хлорофиллы а н 5), а также несколько желтых пигментов (каротиноилов). Метод был позван хроматографией (сЬгощо (греч.) — ивет и ясара)п (греч.) — пишу). Адсорбци- 10' 1. ООНОННЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ 148 1,6 1.4 О 1,2 о \,0 гт 08 0:,6 й 0,4 0 2 4 б 8 \О 12 Ы 16 18 20 22 24 Номер крабкркк Рис.
5.12. Протнвоточное распределение смеси четырех органических кислот. Пики слева направо соответствуют уксусной, пропионовой, масляной и валериановой кислотам. Содержание кислоты в каждой пробирке определялось путем тптроваиия рзствооом едкого пятра. 1Сгпте 1, С„ Сгагп В., р. 17!, 1п: ТесЬп111це о1 Огда- п1с С11еш181гу, чо1.
3, 1п1егэс1епсе Р03118Ьегз, 1пс. 14етт Уота 1%0.1 ониая хроматография на таких веществах, как древесный уголь, оксвд злюмп- ИИН, ДпатОМИтОВЫЕ ЗЕМЛИ И СИЛИКЭГЕЛгь ШВРОКО ИСПОЛЬЗУЕТСЯ ДЛЯ РаЗДЕЛСНИЯ многих типов веществ. Разделение определяется рззличиямп в адсарбции веществ на поверхности определенных эдсорбеитоа, осуществляемой посредством дипольных взэямолействий, водородных связей, э также гидрофобных взаимо- действий. 5.8.3.2. Распределительиая хроматография Этот каскадный метод был разработав в процессе поиска простого мезолэ противоточного распределеиия. Рассуждение строилось следующим образом: если иеподвихсиую фазу закрепить на твердом инертном носителе в цилиадрической колоике. а подвижную фазу пропускать через колонку в условиях равновесия с иеподвижиой фазой, смесь рэстворенных веществ будет разделяться по мере того, как подвижная фаза будет проходить через колонку.
ПервонаЧЭЛЬИО В КаЧЕСтВЕ ТВЕРДОГО НОСИТЕЛЯ ИСПОЛЬЗОВазп СИЛИКЭГЕЛгь КОтОРЫй ИЭСЫ- щели водой, содержащей индикатор мегилоранж, а в качестве подвижкой фазы — хлороформ, насыщенный водой. Было обнаружено, что, если Х-эцетильиые производные аминокислот растворить в небольшом объеме подвижной фазы, нанести иа такую колонку, э затем пропускать через иее подвижную фазу, то эти производные движутся с резными скоростями. 14-Дцетильиые произволпыс аминокислот в достаточно сильные кислоты и меияют цвет метилораижэ; поэтому оии образуют в колонке красные полосы иа желтом фоне, кэк показана на рпс 5.13, и их движение хорошо заметно.
Каждую фракцию собирали по мере выходе из колонки. С помощью этого метола нельзя разделить все 14-ацетил. аминокислоты, однзко при использовании нескольких систем растворителей и различных колонок ряд производных удалось выделись в виде препаратов вы- Б. ПКЛК1!. 1! 149 Рис. 5.13. Принципиальная схема простейшего типа хроматографии. Прежде всего готовят колонку с подходящим адсорбентом (слева).
Раствор, содержащий смесь четырех веществ, наносят сверху на колонку и дают ему медленно «впитаться» в нее под действием склы тнжестн нли небольшого разрежения, созданного а колбе. При этом смесь адсорбнруется в виде узкой полосы в верхней части колонки (в центре). При пропускании элюснта через колонку сверху вниз смесь разделяется, а поскольку вещества онрашены, то в колонке появляютсн четыре дискретные зоны (справа). токой чистоты. Основной механизм разделения на такой колонке заклточается в распределении ациламинокислот между неподвижной (вода) и подвижной [хлороформ) фазамн, как и в случае противоточного распределения; при этом небольшой отрезок колонки эквивалентен одной стадии противоточного распределения.
Хотя некоторая адсорбция на снликагеле и влияет на подвижность кислот, метод был назван жидкостной хроматографией. Затем в качестве твердого носителя лля разделения модифицированных аминокислот стали использовать фильтровальную бумагу. Хроматография на бумаге, единственный широко применяемый в биохимии вид жидкостной хроматографии, является одним из наиболее эффективных аналитических методов разделения.
Полоску фильтровальной бумаги, на которую недалека от верхнего конца нанесено некоторое количество смеси аминокислот, насыщают водной неподвижной фазой и помещают в камеру, насьпценную парами обеих фаз; верхний конец полоски опускают в лодочку, содержащую подвижную фазу, н закрепляют в ней.
Подвижная фаза под действием капиллярных сил поступает из лодочки и движется далее вниз по полоске бумаги. Индивидуальныс аминокислоты переме1цаются вннэ по бумаге с различными споростями, завнснщими от их коэффициентов распределения для данной пары фаз (по аналогии с противоточным распределением или калоночпой жидкостной хроматографией). Порядок движения аминокислот па бумаге различен в разных растворителях, и ни один из применяемых растворителей не позволяет произвести полное разделение всех 20 аминокислот, но, используя хроматографированне в двух перпендикулярных направлениях (рис. 5.14), можно добиться полного их разделения. Аминокислоты можно обнаружить, опрыскивая бумагу раствором пин)пдрнна, что приводит к появлению синеватых окрашенных пятен аминокислот.
Описанная методика соотнетстзует нисходящей бумажной хроматографии. Иногда в Г. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ 1,00 0,6 а,э м ч ч Я и ь 0,6 1.0 Яр Рис. 5.14. Разделение смеси амииокислот с помощью двумерной хроматографии иа бумаге. В первом ваправлеиии ислользоваив смесь растворителей н-бутаиол— уксусная кислота — вода (250: 50: 250 по объему), а во втором иаправлеиии— смесь феиол †во — аммиак (120: 20: 0,3эя). !гя фронта растворителей в обоих направлениях принято равным !.
Сокращеиия названий аминокислот см. табл.4.1. одном или в обоих иаправлеииях вполие успешио примеииется восходяа(ая бутманах крамагографиц Жидкостная распределптельиая хроматография иа бумаге используется дли разделеиия очень многих типов веществ, включан простые углеводы, липиды, иуклеотиды и пептялы. Кроме того, разработаиы рззличиые модификации этого метода, в которых целлюлоза заменена синтетическими полимерами, крсмиеземом, окисью алюмииия илп производиыми целлюлозы.
Для проведеиия хроматографии могут быть использоваиы самые разнообразные растворителя. В одной из разиоввдиосгей этого метода, иазь|ваемой гонкасяойнай хроматографией, смесь веществ разделяется с помощью восходящей хроматографии па твердом носителе, нанесенном равиомериым тоиким слоем иа стекляииую илв пластмассовую пластинку. Другой метод распределптельиой хроматографвя — гаэожидкостная хроматография в особенно пригоден для разделеиия легколетучих веществ. Первака. чальио применение этого метода ограничивалось разделением летучих углеводородов и жириых кислот, одиако сейчас ои используется и для разделения летучих производных липидов, мопосахаридов, амииокислот, стероидов и других веществ, представляющих биологический интерес. В газоэкидкостиой хроматографии стскляипая или металлическая колонка длиной 1 — 2 м и диаметром 0,2 — 1 см заполияетгя тоикоизмельчеипыии частицами писртиого твердого иосителв (иапрпмер, диатомитовая аемля иля огнеупорный кирпич], пропитапиыми иелетучими ипгдкостями (смазочными или силвкоиовыми маслами либо полиэфирами высокоиолекуляриых Огяртов и двух- 151 5.
БЕЛКИ. И Е 5 то 15 20 Время,миь ! Рис. 5,15. Газожидкостное хроматографическое разделение метнловых эфиров жирных кислот. присутствующих в нормальной плазме крови крысы в виде эфиров холестерина. Цифры у пиков указывают число атомов углерода (первая цифра) и число двойных связей в данной кислоте (вторая цифра). Площади пиков пропорциональны относительным количествам жирных кислот в смесн. (С любез- ного разрешення д-ра Л. Гайдеза). основных кислот). В колонке по всей ее длине поддерживается повышенная температура (170 †2'С); смесь анализируемых летучих веществ вводится в верхнюю часть колонки и быстро там испаряется.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
