Главная » Просмотр файлов » Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_1

Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_1 (1123309), страница 32

Файл №1123309 Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_1 (А. Уайт - Основы биохимии в 3-х томах) 32 страницаOsnovy_biokhimii_Uayt_tom_1 (1123309) страница 322019-05-10СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 32)

Этот биологический метод установления гомогенности белковых препаратов может быть таким же чувствительным, как методы, основанные на детекцни по знзиматическому или гормональному действию, при условии, что примеси обладают антигенными свойствами. Количество белка-антигена в растворе можно определить путем добавления специфической антисывороткп (гл. 30) с последующим отделением образующегося осадка и определением его количества любым доступным методом. См. литературу к гл. б. Глава 6 БЕЛКИ.

П1 Аминокислотная последовательность и конформаиия белков Принято рассматривать четыре уровня структурной организации белков. Термин первичная структура относится к аминокислотной последовательности н используется часто наряду с термином ковалентная структура. Термин вторичная структура характеризует различные типы регулярных структур, встречающихся во многих белках, например спиральные структуры (а-спирали), образованные единичной полипептидной цепью, и складчатые листы (р-структуры), образованные двуми или несколькими участками цепи. Термин третичная структура характеризует конформацию белка в целом, его пространственную структуру.

Термин четвертичная структура относится к пространственному взаиморасположению субьединиц белка, если таковые существуют. Вторичную, третичную и четвертичную структуры в совокупности часто называют нековалентной структурой. 6.1. Первичная структура 6.1.1. Аминокислотный состав Прежде чем определять ампнокислотную последовательность белка, необходимо установить его аминокислотный состав. При этом можно использовать различные методы (разд. 4.1.3.3 н след.). Наиболее широко применяемый в настоящее время количественный метод аминокислотного анализа белкового гидролизата основан на использовании ионообменной хроматографии (равд. 5.6.3.3 и след.).

Белок обычно гидролизуют в 6 н. НС! при 100'С в течение 20 и более часов в отсутствие воздуха. Как правило, проводят несколько параллельных опытов с различной продолжятельностью гидролиэа; прн этом удается оценить скорость разрушения лабнльных аминокислот, таких, как серии„ треонин и тирознн, а также добиться полноты гидролиза наиболее стабильных пептидных связей, особенно образованных остатками изолейцина и валина. При кислотном гндролизе разрушается триптофан„его можно опреде- б. валки.

пь белок р-Лсориептостеиол ны, 2 НС вЂ” СНс — 5Н + НΠ— СН вЂ” СН вЂ” 5 — 5 — СНе — СНсОН о=с' нл, йС вЂ” СН,— 5Н + ~ — СН,— СОО- о=с белок сн.. 5 СН.. Нсы — С вЂ” СООН акарбоиспсис иичисп сии НЛ НС вЂ” СНс — 5 — СНс — СОО о==с.' НН О б НС вЂ” СН,— 5Н ~иси сипри,оип)+ НС вЂ” ООН вЂ” 57" и О=С' белок 5О,Н СН,, НХ НС вЂ” СНс -5ОсН,"„ и О=-С Неы — С вЂ” СОсН Н Нисспсиносси кислнпа лить спектрофотометрическнми методами.

Глутамин н аспарагин превращаются в соответствующие дикарбоновые кислоты; однако амиды могут быть определены после исчерпывающего гпдролнза протеолитическнми ферментами нлн непосредственно при установлении аминокислотной последовательности. Содержание цистеина и цистина в белках трудно оценивать количественно при исследовании гидролизатов обычными методами, поскольку зги остатки частично разрушаются прн кислотном гидролизе, плохо разделяются в ходе ионообменной хроматографии и слабо окрашиваются нингидрином.

Суммарное содержание цистеина и цнстина можно точно определить двумя методами. Ниже приведены соответствующие схемы реакций: НХ С=О О=с~ Е ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ Если обработать белок избытком надмуравьиной кислоты, то остатки цнстепна и цистина окисляются до остатков цистенновой кислоты. При полном гидролизе цистеиновая кислота освобождается почти количественно и легко определяется с помощью панообменной хроматографии. В другом методе дпсульфидные связи восстанавливают избытком меркаптоэтанола в 6 81 гуанпдннгндрохлориде; при этом образуются остатки цнстеина. Последние прн реакции с иодацетатом превращаются в остатки 5-карбоксиметилцистеина. Ь-Карбоксиметилцнстеин стабилен при кислотном гидро- лизе в присутствии восстановителей и может быть определен пучем ионообменной хроматографии.

По результатам определения содержания цнстеиновой кислоты или 5-карбоксиметилцистеина нельзя судить о том, присутствуют лн в белке цистеин и цистин или только один нз них. Таким образом, по числу остатков цистеиновой кислоты или Ь-карбоксиметилцистеина судят о содержании полуцистина. Для установления соотношения между цнстенном и цистином в белке можно определить содержание тиоловых групп (т, е, содержание цпстеина) различнымн методами, например с помощью реагента Эллмана (разд. 4.1.3.3). Если известно суммарное содержание полуцистнна н определено количество тиоловых групп (цистенна), можно рассчитать содержание в белке цистина.

Приведенные в табл. 6.1 данные показывают, что аминокислотный состав представленных белков существенно различается. Например, в гормоне инсулине отсутствуют трпптофан и метионнн, а в многлобине — цпстеин и цистпн. В табл. 6,1 содержание различных аминокислот выражено в граммах на 100 г исходного белка; прп суммировании получим, что на 100 г белка приходится 118 г аминокислот (с учетом одной молекулы воды на каждую гидролпзуемую пептидную связь). Если же при расчете содержания аминокислот учитывать массу аминокислогных остатков, а не свободных аминокислот, то суммарное содержание аминокислот в белке, не содержащем неаминокислотных компонентов, должно составлять 100%.

Приведем пример такого расчета. При гидролнзе инсулина образуется 8,6 г свободного фенилаланнна на 100 г белка (табл. 6.1). В пересчете на массу аминокислотного остатка это составляет 8,6. 147/165=-7,7 г на 100 г белка, поскольку молекулярная масса фенилаланииа 165, а масса остатка фенилаланнна в белках 147.

При изучении структуры белка более информативен другой метод выражения данных аминокислотного анализа. Если известна молекулярная масса белка, то можно рассчитать число ампнокпслотных остатков в молекуле; оно должно быть целым, поскольку в белке не может присутствовать часть остатка. Зтп значения также приведены в табл.

6.1. 166 В. БЕЛКИ. $$$. о„' с оо »6 х СО" о 44 . С.™ О о х»Е С Охо СО СС О Л. », » х а х О Я 4 СЧ СЧ ЯЯ хо Б оо о 6 ох О, х » Р «$ 4$ СС Ы 4:$ О х х О оа«с. Са в" о со" а«" о- о О СО о с ол сч л-в о $ ССЧ' С.О з Й В О з В О са с- — сМ СО ° В 6 хх «$ Х ° 4 "Х "хх 2и~~.( СС О х хах фхх х ах ОЧХХХОХ Сх~ ь'.с.а,а:~ О х 'а Се О $ а Ь, ф х х Ю х х 4$ СС и О д лоомломлмлч о счл С4 саоса сч 4«аоксчсчюсчсч СС С Ч' МСЧММ Са СЧСО ОСОСЧСОСОЧ'СЧОСО«4"С ч'сса« 4'о 4 ч' «СО с"Со са 4'ч'ос м сс о)~ О 'Ф СОСО«О СООССС «сОО«со $'СЧ осчла« .ото ч'О« СОСО ссчсчо Рмм-" соо".с- СЧ 4' \ 4 СО СО 4а \ 4 о Са \ сч м сч о ю сч о сч о сч о х х х Х «4 Оххххаа,~х ».СайО$-ЛЛХСО ~ основные компоненты клетки 170 6.1.2.

Субъедииичная струк~ура Прежде чгм анализировать последовательность аминокислот в белке, необходимо определить, содержит ли белок одну субъеднницу (полипептилиую цепь) нли состоит из нескольких субъедннпц. Если обнаружено несколько субъедншщ, следует установить, идентичны ли их аминокислотные последовательности и связаны ли они межцепочечнымп дисульфидпыми мостиками. Для получения необходимой информации особенно полезны методы определения молекулярных масс в различных условиях (гл. 5). В настоящее время обычно проводят седиментационво-равновесный анализ на ультрацентрпфуге. Важно прежде всего определить молекулярную массу белка в его нативной конформации, затем молекулярную массу белка в 6 М растворе гуанидннгндрохлорида, который денатурирует молекулу, разрушая ее третичную и четвертичную структуру.

Если в обоих случаях получают одно и то же значение, то белок содержит либо единственную полппептидную цепь, либо две илн более цепей, соединенных дисульфидными мостиками. Далее молекулярную массу определяют в присутствии смеси 6 М раствора гуанидингидрохлорида и меркаптоэтанола, при этом в дополнение к разрушению третичной и четвертичной структур восстанавливаются днсульфидные мостики. Если все три метода дают одно н то же значение молекулярной массы, то значит белок содержит одну полипептидную цепь.

Если же при определении в гуанпдингидрохлориде значение оказывается меньшим, но совпадает с найденным в смеси гуанидингидрохлорида и меркаптоэтанола, то, по-видимому, в белке содержится несколько субъединнц, не связанных днсульфидными мостиками. В этом случае молекулярная масса, определенная в растворе гуанкдингидрохлорида, должна быть кратной молекулярной массе нативного белка, т. е. если она равна половине массы нативной молекулы, то белок, вероятно, содержит две субъединицы, если же одной четверти — четыре субъединицы и т. д.

Характеристики

Тип файла
DJVU-файл
Размер
7,28 Mb
Тип материала
Предмет
Высшее учебное заведение

Список файлов книги

Свежие статьи
Популярно сейчас
Почему делать на заказ в разы дороже, чем купить готовую учебную работу на СтудИзбе? Наши учебные работы продаются каждый год, тогда как большинство заказов выполняются с нуля. Найдите подходящий учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6384
Авторов
на СтудИзбе
308
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее