Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_1 (1123309), страница 35
Текст из файла (страница 35)
Второй набор пептидов обычно получают с помощью химотрипсина или пепсина, которые дают, как 12е 1. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ тва-таЬЛвп-С1и-НМ-Ьаи-Суаозн-С1у-Зпг-Эна-Ьаи-'паЬС1и-Л1а-1.еи-туг-1ли-ЪГьЬСуэозн-С!У-С!и- .1 1 1111 с1 1 зьгн С1У-Иа-И т -твг-Г -ь Лв 111 11 т1 1 Унс. 6.2. Действие некоторых крнсталлвческнх протеолнтнческнх ферментов на В-цепь окисленного инсулина. Сплошные стрелка указывают на основные места действия ферментов, штрнховые стрелки — на другие связи, расщепляемые ферментами. В ходе окяслення остаткн цистнна 1Су8 — 8Су) были превращены в остатки цвстевновой кислоты 1Су80аН).
Р— связи, гндролнзуемые пепснном, С вЂ” хныотрипсином, Т вЂ” трипсвном. ~8алдег г., Тирр)у Нп В)осташ. Л., 49, 481, 195Ц правило, больше пептидов, чем трнпснн, но полученные смеси обычно пе столь сложны, как прн нспользованни папаина. термо.лизина или зластазы. С целью расширения области применения фермент,щ разработано несколько приемов. Например, превращение остатков цнстенна в 8-амнноэтнлцнстеиномые остатки прн действии этнленимнна делае~ возможным расщепление трнпсином связей этих остатков по карбоннльным группам. ! О ЫН о ын — Ын — сн,— зн+ н,с — сн, — — ~ — ~н — сн,— з — сн,— сн,нн, Н опгпавпн цнипаина авнланнинн опаивал 3.
аминпзвнлцнаванна Модификация лизина нлн арганкна может огракнчнть дсйствнс трипсина. Ацнлнрованне е-ампногрупп остатков лкзнна прн нейтральных рН действием малеинового нлн пятракокозого ангидрида делает люзпфипнрованный остаток .лизина устойчивым к трипсину, сводя протсолиз к расщеплению по остаткам .аргянияа.
О О н хн нс-сл унн н с=с~ нс — с с=из о У О пипапоп лизина пупвфпп аинлнрпаання Ыалаинааий ангидрид Маленльная ялк цнтраконнльпая группы легко сннмаются прн комнатной температуре под действием слабой кнслоты (рН 2,5 — З,О), затем тркпсяном могут быть гидролнзованы связи, образованные остатками лнзннз. в. вилки. иь Аналогично этому остатки аргинина взаимодействуют прн рН й — 9 с циклогексааднопом (илп другим дикарбонильным реагентам), образующим аддукт с гуанидиновой группировкой.
Барачный комплекс с вицннальными гицроксидными ~руппами аддуита стабилизирует образованную структуру." им м ! Н,ы е ыи ! неравный намннене гианндинееая гринннрына аддуны Действие трипсина на обработанные таким образом полипептиды или белки сво- дктса к гидролизу по остаткам лизина. Аргинин может быть регеперирован действием гидроксиламина, аммиака или другого нуклеофильного реагента при слабощелочных рН. гомоеернн нанеын геыоеерюа б.2.2.2.
Специфическое химическое расщепление Специфический химический метод расщепления по остаткам метноннна основан на использовании бромциана 1СИВг) в кислой среде, например в 90%-ной муравьиной кислоте: О О !! П' — С вЂ” ЫН вЂ” СН вЂ” С вЂ” ХН вЂ” Н Г вЂ” С вЂ” !ЧН вЂ” СН вЂ” С=43 + Н Н вЂ”.Гч ! ! НС О СН,9СН Н,С + С Н Н,С вЂ” 9+ С!Ч ! .ь Вг 'СООН-Концевой остаток пептнда теперь представляет собой лак-гон гомосерина. При гидролизе 6 н.
НС1 в описанных выше условиях (разд. 6.1.1) происходит отщепление гомосерина и его лакхоиа: НΠ— СН вЂ” СН вЂ” — СООН Н 182 ь ОснОВные кОмпОненты клетки Поскольку большинство белков содержит относительно небольшое число остатков метионина, метод очень удобен для получения больших пептидов.
6.2.3. Вьшеление пептидов Пептиды, образованные при частичном гидролнзе, могут быть разделены с помощью целого ряда методов, среди которых наиболее широко применяются гель-фильтрация, ионообменная хроматография и электрофорез на бумаге (гл. 5). Обычно только часть пептидов можно получить в чистом ниде с помощью одного нз этих методов; смеси пептидов, полученные прн разделении одпям из методов, должны быть подвергнуты дальнейшему разделению другим методом. Очистка больших гидрофобных пептидов часто вызывает затруднения, но в подобных случаях с успехом применялись такие методы, как гель-фильтрация в водных растворах кислот (например, в 50')о-ной уксусной или муравьиной кислоте) или в растворах мочевины или гуанидингидрохлорида (от 2 дО 6 моль/л).
Благоприятным обстоятельством является доступность различных молекулярных снт, широко применяемых на практике для очистки пептидов (табл. 5.6). 6.2.4. Анализ последовательности аминокислот в пептндах Аминокислотная последовательность небольших индивидуальных пептидов может быть определена с помощью метода гидролиза ферментами, отщепляющими 5(На и СООН-концевые остатки, в сочетании со ступенчатым фенилтиогидантоиновым методом*.
Для более крупных пептидов может оказаться необходимым дополнительный гидролиз другим протеолитическим ферментом. Так, пептид, полученный при расщеплении трипсином и имеющий структуру А. В С.Туг Е Р.О Н Еуз (где А, В, С, Е, Р, О и Н вЂ” алифатические остатки типа глицина, аланина, сернна и т. д.), может быть гндролизован химотрнпсином по остатку тярозина с образованием пептидов А.В.С Туг и Е.Р.О Н.Еуз.
Поскольку положение этих двух пептидов относительно друг друга уже установлено (пептид, содержащий остаток тирозина,— ИНз-концевой, а пептид, содержащий остаток лизина, СООН-концевой), дальнейшая работа по установлению последовательности сравнительно проста. 6.2.5. Локализация дисульфидных мостиков Положение остатков полуцистнна, образующих дисульфидные. связи в белках, устанавливается в процессе выяснения полной ами- * В настоящее время наяболее успешно нспользуется аысокоэффектяявая хроматографня, в том числе на обращенных фазах 1Зпгелыардг Х.
7Кнлкостнам хроматография прн высоких давлеяяях. м.: мнр, 19862 — прим. ред. б. Белки, нь 2 3 С С .Н, РН 5,6,4 НЕ С 6РНЮ С, СНРЕПС С О ГО 56 и! и Ьусссуе-Ага Ть. -5с Рго-О! -А 5 О! .АЬ-ТЬь 1 2 3 4 .. Рис,а; ! СЬ-АЬ 6 7 в Рг Су !Ае б 55 56 24 к 1-5 ог .Аь-ть, -с 6 7 6 О!н.льп-ьус 5 46 41 44 1-А-1-5 г-А-1-сь Не-тус.Аьп-рге-уе1-оуь!Ан! Оунвг-Аьрвву-В -Твг-Туг 19 26 11 22 23 24 25 25 27 26 29 55 31 туис. 6.3.
Диаграмма иабнрательиого фермеитатнвного расщеплении и определения амниокнслатиой последовательности малева.$-2-аминоатилцнстеиннлпронвводного ингибиторв 1 свиного панкреатического трипсина. Стрелкамв нвд аминокнслотпыми остатками отмечены результаты деградации по эдману ( — 1.) и расщеплении иарбоксипептидввами А и В ( 4 †). перечеркнутые стрелки ( -х †, — х - ) укавыввют на беауспещные попытки исследовать пептнд методом, обоаначенным соответствующкм напрвнлением стрелки. Як — либо остаток глутаминв, либо остаток тлутаминовой кислоты.рваггеИ 12. Сн буреве 1 /н 2.
Вю!. С(ющ., 246, 22!8, 1971.1 иокислотной последовательности. Для белков, обладающих дксульфидными связями, но лишенных тиоловых групп, обычно возможно провести гидролиз натнвного объекта одним или несколькими протеолитическнми ферментами н выделить только цистинсодержап(не пептиды.
Наиболее подходяшие для этой цели ферменты— пенсии и термолнзин. Активность пепсина оптимальна между рН ( н 4, а активность термолизина — между рН 6 и 6,6. При таких концентрациях Н+ дисульфидпые связи остаются неповрежденными. Когда получен чистый цистинсодержаший пептид, его восстанавливают меркаптоэтанолом и алкилируют иодуксусной кислотой; два образованных пептида разделяют и определяют состав каж- 76..5 Р 1 184 !. ОснОВные кОмпОнгнт! ! Клег! ц 1ЧН, Ркс. 8.4. Полная вмявокнслотнвя последовательность ннгнонторв 1 свиного пвнкревтнческого трнпснна с указанием положення лясульфнлных связей. 1бпу О. 87!арапйа 11., Огеепе Я.
!„А В1о1. Спенс, 24в, 7740, 197Ц дого из них. Поскольку известна аминокислотная последовательность в районе каждого остатка полуцистнна, легко понять, какие именно два Остатка образу!От дисульфндную связь. Цистинсодержащие пептиды не должны подвергаться действию щелочей нлн очень сильных кислот, так как днсульфидные связи могут разрушаться и в Образующихся продуктах может происходить дисульфндный обмен. В том случае, когда и тиоловые группы, и дисульфидные связи присутствуют в одной и той же молекуле, можно установить, какие именно остатки полуцистина образуют дисульфидные мостики, предварительно проведя реакцию белка в денатурирующнх условиях с !4С-иодацетатом, алкилнрующнм все свободные тиоловые группы и не затрагивающим дисульфидные связи.
И дисульфиды, и свободные тиоловые группы могут быть затем локализованы в амннокислотной последовательности, как описано выше. 6.2.6. Аминокислотная последовательность ингибнтора 1 свиного панкреатического трипснпа Описанные выше методы анализа использовались для установления аминокислотных последовательностей многих белков. Чтобы проиллюстрировать применение этих методов на одном белке относительно небольшого размера, на рнс.
6.3 приведена общая схема установления последовательности белкового ингнбитора панкре- 6. Белки. Пь атпческого трипсина. Белок прежде всего восстанавливали меркаптоэтаиолом и аминоэтилировали. Б->гминоэтилированный белок обрабатывали малеиновым ангидридом с целью защиты аминогрупп лизина и Ь-аминоэтилцистеина, а затем расщепляли трипсииом.
Полученные пептиды.разделяли с помощью гель-фильтрации. Ход дальнейшего анализа последовательности, включая методы частичного гидролиза и разделения пептидов, также показан на рисунке. Окончательный вариант аминокислотной последовательности с правильным расположением дисульфидных мостиков представлен на рис. 6.4. 6.3. Конформации белков В настоя>цее время изучена конформация многих белков. Первая работа, в которой сообщалось об установлении полной трехмерной структуры белка 1а именно миоглобипа кашалота), опубликована в 1961 г. Конформации миоглобина была выяснена с помощью рентгеноструктурного анализа его кристаллов.
Этот метод и в настоящее время представляет собой уникальное средство, позволяющее получать данные о пространственном расположении атомов в молекуле белка. Однако точность кристаллографического метода структурного анализа белка пока не достаточна для того, чтобы устанавливать конформацию белка без знания его аминокислатной последовательности. Последнее весьма существенно при интерпретированни кристаллографических данных. В этом разделе рассмотрен метод рентгеноструктурного анализа, а так>хе представлены основные типы вторичных н третичных структур, обнаруженных в глобулярных белках. Здесь же обсуждаются методы исследования некоторых общих конформационных свойств белков. 6.3.!.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
