Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_1 (1123309), страница 39
Текст из файла (страница 39)
Во многих белках обычна ионизуется лишь часть остатков тирозина, в то время как полная ионизация всех тирозннов наблюдается лишь прн денатурацви (разд. 4.22). Следовательно, изменения в спектрах поглощения могут быть использованы для оценки изменений в химическом окружении ароматических осгаткон и конформационных изменений в белках в целом. Изменение состояния белка и его хромофоров удобно исследовать путем снятии дифференциальных спектров, т. е.
ну»ем прямой регистрации разности поглощения белка при двух различных условиях. например пря изменения рН, добавлении мочевнны н т, д Изменения н дифференциальных спентрах нативных и денатурированных белков обычно а 1О раз выше в области 230 нм, чем в области 280 нм. 6.8.2. Оптическое вращение белков Растворы всех белков способны вращать плосность поляризации света, проходящего через ннх.
Это происходит, в частности, вследствие присутствии в молекулах белков остатков оптически активных аминокислот. В то же времн изучение даже сравнительно простых молекул показывает, что знак и величина оптического вращения зависят не только от природы атомов и групп, связан. ных с асимметрическими атомами углерода, но и от взаимного расположения асимметрических углеродных атомов. Отсюда следует, что изменение в структуре или конформации белковых молекул может отражаться на величине его удельного вращении. Удельное оптическое врагценне белков всегда отрицательно и для глобулярных белков лежит в области от — 30 до — 30'. Например, удельное вращение (а)п растворов овальбул»ина с рН 3,5 до 1! равно приблизительно — 30; хотя эффективный заряд молекулы изменяется при этих рН от +20 до — 30.
Следовательно, ионизация молекулы ъ»ало или совсем не влияет на ее удельное вращение. Однако прн более высоких пли более низких рН значение удельного вращения становится более отрицательным. Например, прн рН !3 (о)п равно около — 50'. диалогично в 8 М растворе мочевины (а)о= †'. Такое жс увеличение отрицательного удельного вращения белков наблюдается и при повышении темпе. рагуры, Если возрастание отрицательного вращения бе.тков не сопровождается разрывом пептидных связей, она всегда свидетельствует об изменении ионфор. мании белка, в основе которого лежат изменения в его вторичной и третнчной структурах. !.
ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ 202 Рис. 838. Дисперсия оптического вращения в УФ-области для спиральной конфигурации полн-а-1.- глутаминовой кислоты в воде прп рН 4,3 (1) н конформации упорядоченного клубка дзя ее натриеиой соли при рН 7,1 (2). На оси ординат отложены величины оптического вращения на адин амннокнслотный остаток. (В(ои! Н. Я., Всат!ег й, Б!тпгояз Л'. 3., 3.
йзп. Сйеш. $00., 84. 3193, !Юбое) 40 го -20 !ВО 200 220 240 2бо 280 Л,нм 6.8.8. Дисперсия оптического вращения Зтот метод, основанный на изменении оптического вращения с изменением длин волн монохроматического света, дает дополнительную информацию а структуре белка. Для синтетических полипептидов, таких, как поли-).-глутамииовая кислота, кривые дисперсии различны лля конформации неупорядоченного клубка, образующегося прп рН Т н спиральной конформации, образугощейся пря р!1 4,3 (рис. 6.18). Различие кривых дисперсии обнаружено также для нативных и денатурированных белков. Для расчета процентного содержания спиральных форм а белках используются различные формулы, выведенные теоретическим или эмпирическим путем.
Однако в настоящее время пр!тоднтся констатировать, что такого рода методы не могут давать точных абсототпых значений, а способны лишь регистрировать изменении в содержании а-спиральных форм у глобулярных белков, многие из которых имеют всего 0 — !О""гю а другие — до 70--8074 аминокислотных остатков в атой конфигурации. Зти методы представляют особую ценность при наблюдекии коиформационных переходов в белках, в то время как точное определение конформации и процента спиральности достигается сейчас лишь на основе данных рентгеноструктуриого анализа. е. Бельм ыг. В.ВА. Круговой дихроизм Этим методом измеряетсв разность э поглок(енпп левого и правого циркулярно-поляризованных лучей света. В области оптически активных полос поглощения кривые дисперсии оптического вращения н кругового дихроизма имеют характеристические экстремумы, показанные на рис.
6.19. Оба явления, иллюстрирующие как неравные скорости пропускаиия света (дисперсия оптического врюценвя, ДОВ), так и неодинаковое его поглогценне (круговой дихроизм, КД), получили название эффектов Коттона. Такого рода эффекты Коттона в простых белках ассоциируются с наличием у полипептндов полос поглощения в областях 190 †2 нм (пептидная связь) и 280 †2 им (где доминируют полосы поглощения ароматических боковых цепей трвптофана я тирозина).
Форма и амплитуда кривых ДОВ и КД очень зависят от конформации белков, а также химического окружения хромофоров боковых цепей. 6З. Денатурация белков Под денатурапней понггмают пгнрокнй спектр структурных изменений в белках, а тактке различные способы воздействия на нн- Ннс. 6.19. Теоретические соотношения оптически активных полос поглощения света и оптического вращения (а), а также оптически активных полос погтощеннн н кругового дихроизма (б), т(к) — полярное оптическое вращение при длине волны )ь; а(Х) — коэффициент экстинцви полосы поглощения; 0(Х) — элтиптичность ячи разность поглощения левого н правого циркулярно-поляризованных лучей све- та. 1Веусйой 5., Яс)енсе, 154, 1%8„196а1 !.
Осповныв компоненты клетки днвндуальныс белки. С химической точки зрения денатурация представляет собой сложный процесс, а точное описанпе характера взаимодействия белка и денатурирующсго агента, приводящего к изменению конформации, не всегда возможно. Во всяком случае. все денатурпрующие агенты в той нлп иной мере разрушают пековалентную структуру натпвного белка. Для одних белков незначительные изменения в конформации пе всегда приводят к потере биологической активности, а для других даже незначительные конформационные перестройки, не все~да фиксируемые обычными методами, могут вести к полной инактивации белка. Наиболее распространенные денатурирующие агенты — гуанпдипгпдрохлорид и мочевппа. Большинство белков оказываются полностью денатурированными в водных 6 — 8 М растворах гуаиидингндрохлорида и в 8--10 М растворах мочевпны.
В этих условиях натнвная конформация обычно полностью разрушается и белок принимает конформацию неупорядоченного клубка, в которой отсутствуют нековалентные взаимодействия между атомами и группами, а все пространственные формы молекулы оказываются легко взанмопревращающнмися и способными вступать в контакт с растворителем. Гпдрофобные К-груп!!ы белков в концентрированных растворах мочевины и гуанпдпнп!дрохлор!па становятся менее экранированными, и, следовательно, денатурацпя такого рода вызывает нарушение гидрофобных взаимодействий. Это согласуется с фактом повышенной растворимости гидрофобных соединений в концентрированных водных растворах мочевины а гуанидингидрохлорида. Неводные растворители, по всей вероятности, также способны денатурировать белки, вызывая нарушения гидрофобных взаимодействий; это имеет место, например, в водно-спнртовых растворах.
В некоторых неводных растворителях белки часто приобретают конформацию с большим содержанием спиралей. Детергенты образуют с полнпептидами прочные комплексы, вызывая глубокие струк~урные перестройки, как это было уже показано на примере додецилсульфата натрия (равд. 5.1.7). Денатурацня растворенных белков обычно происходит прн температуре 50 — 60"С и требует различного времени. но точное значение температуры, вызывающей конформационный переход, варьируется в широких пределах для различных белков.
Например, некоторые ферменты инактивиру!отся даже при охлаждении от 30 до 0'С (холод-лабильные ферменты). Тепловая дснатурапня часто оказывается обратимой, по во многих случаях агрегация белка сопровождается его осаждением из раствора. Причиной денатурацни белков может быть также изменение рН. Понятно, что характер электростатических взаимодействий в полипептидных цепях белков су!цественным образом зависит от рН. Однако весьма сложно объяснить, почему данный белок денатурирует прн одном значении б. Белки. тн. рН, а не прн другом. Например, пепснн (РХГИ!) денатурнрует быстро прп нейтральных рН. а рнбонуклеаза (р!=7.8) н лнзопнм (р/=10,8! не претерпевают конформацнонных перестроек даже прн рН 2.
Ьольтпинство белков устойчиво лппть в достаточно узкой области рН. ЛИТЕРАТУРА Книги Л!екалдег Р., 7илйугел Н. Р,, едв., А ЬаЬога!огу Маоиа1 о1 Апа!упса! Ме!Ьодз !п Рго1е!п СЬетппйгу 1пс!и»ппб Ро1урер!Ыев, чо!. 4, Регдапюп Ргеы, Неи» Тогк, 1966. Ал(!лзеи С.
В., Хг., Аляол М. Х., Едва!! Х. Т., !7!саагдя Е. М., едв. Айчаисеь тп Рго!е(п С!»ею(в!гу, Асадепис Ргем, 1пс., Кеы Уогм (Ел»егоднае издание, тон [ которого опубликован в 1944 г.) Ватеу Х. Х... ТесЬБ!Чиез о1 Рго1етп С1»ып1мгу, 2й ед.. Атпег1сап Е!веыег РиЫийипд Сотпрапу, 1пс., Л!сит Уогм 1967. Втек М., Е1ес(горЬогев!в, 26 ей., Асадеиис Ргевв !пс., Л)сы "тогЬ, 1968, Водалзгду М., К!ааялег У. Я., Олде!!! М. А., Рербде Буп!Лев!в, 2пд ей., 1г!егвс»епсе РиЫЫЬегз, й!чпйоп о1 ХоЬп Ж!1еу й Бонз, 1пс., Иеы тогЬ, !976. Спал Е.
Х., Едзап Х. Т., Рго1е!пв, Анино АсЫз, апд Рер1Ыез аь 1опв апй Ибро!аг !опв, Ее!пЬо16 РиЫ(з)т!пб Согрогапоп, Л!еит То»Ь,!942. Рауао)1 М., ед., Абаз о1 Рго!е!п Баб»»енсе апд Б!гис!иге, чо1. 5, Набопа! В!огаед1- са1 !!евеагсЬ Роипданоп, 1972; Барр!степ! 1 1о чо1. 5, апд Барр!степ! 2 !о чо1. 5. (В сборнике приведены последовательности белков и нуклеиноныл кислот, опубликованные до 1976 г. включительно.) О!с)тегзол !7. Е., Осы Х., ТЬе БмисШге апд Аспоп о1 Рго1е!пя, 9»т. А. Веп)атпш, 1пс., РиЫЫЛегв, Меп!о Раг1», Са1!1., 1969.
Едва!! Х. Т., 6гутал Х., ВторЬуюса! СЬып(в!гу, чо1. 1, ТЛеппойупатп!св, Е!ес1гоь!аВсз, апд !Ье Вю!ойтса! Б!дпШсапсе о1 !Ье Ргорег(мв о! Л1апт, Асадетпм Ргевь, 1пс, Иеы Уо»Ь, !958. Еаьтал О. О., ей., НапдьооЬ о1 В!осЬепив1гу апд Мо1еси!аг Вю1обу» Рго!етпв, 3 чоы., Зд ед., ТЬе С1»ега!са) ЕиЬЬег Со. Ргеы, С!ече!апд, ОЫо, !976, Не)тлталл Е., ед., СЬ»опта!одгарЬу, Зд ей., !»е!п(то!д РиЫМЫпд Согрогапоп„меы Тог1», 1975.
Хйгз С. Н. 97., ед., Епаугпе Б!гис!ттге, 1п» Б. Р. Со1оыюК Л!. О. Кар!ап, едь., Лте!Лойя !п Епаутпо!окч, чо1. Х1, Асадепис Ргеы, 1пс., Иезч Уо»Ь, !967. Н!гв С. Н 97., Т!тозаа)1 Б. Л!., едв. Мераодв 1п Епзутпо1обу, чо1. ХХч', р1. В, Асайепйс Ргевя, 1пс., Нем Уо»Ь, 1972. Меалз О. Е,, Геелеу !7. Е., СЬеииса! Мо»ййсаноп о1 Ргыешв, Но1йеп-пау, 1пс., РиЫ!вЛег, Бап Ггапсмсо„!971. Мызгег А, В!осЬепия!гу о1 ЬЬе Анино АсЫв, 2д ед., 2 чо!з., Асадеппс Ргеы, 1пс., Нси ТогЫ !965.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
