Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_1 (1123309), страница 43
Текст из файла (страница 43)
д. принадлежат к типу 3' — +.5'. Обе цепи являются правовращающими спиралями, закрученными вокруг одной н той же оси. Модель, иллюстрирующая образование спирали пз двух цепей, показана на рис. 7.3. 7.2.5. Синтетические полинуклеотнды Известны полинуклеотиды, содержащие один пли два вира нуклеиновых оснований. Они синтезируются энзиматически с помощью полннуклеотидфосфорилазы и РНК-полимсразы (гл. 26) в случае полирпбонуклсотндов я с помощью ДНК-полимеразы 1 (гл. 25) в случае полядезокснрнбоиуклеотидов. Когда полиаденнловая кислота (ро1у(А)) смешивается с полнуридиловой кислотой (ро!у(0)1, образуется аналогичная ДНК !.
основные компоненты клетки двуспнральная структура с водородными связями между парами А и 0. При определенных условиях могут образоваться и тройные ~пирали, состоящие пз одной нити ро!у(А) и двух нитей ро!у(Б). Дву- и трехспиральные структуры получены также из полиинозиновой я полицитиднловой кпслот. Синтетический полидезоксирибонуклеотид ро!уд(А-Т) имеет двусппральную структуру, в которой каждая цепь обладает опрсделенной чередующейся последовательностью оснований ".ЙА. -!(Т.дА ЙТ ". Методом дифракции рентгеновских лучей установлено, что литиевая соль этого полинуклеотида существует в Б-форме с размерами спирали, идентичными размерам спирали литиевой соли ДНК.
Как и ожидалось, ДНК, построенная только из остатков адсниловой и тимидиновой кислот, имеет очень низкую температуру плавления Т. (см. ниже). Аналогичный сополимер ро1уб(1-С) с чередующимися основаниями имеет размеры спирали н физические свойства, подобные ро1уб(А-Т). Простые полимеры с регулярной структурой, подобные описанным выше, найдены в центромерных областях хромосом эукариот (гл. 25).
Их выделяли с помощью равновесного центрифугнровання ДНК (из тканей животных) в градиенте плотности хлорида цезия; они обнаруживаются в виде сателлитной полосы низкой плотности. Один из сателлитов, присутствующих в ДНК некоторых видов крабов, по составу и последовательности аналогичен ро!у!!(А-Т)-сополимеру с чередующимися основаниями. Он состоит приблизительно на 97% из последовательно чередующихся дезоксиадениловой и тимидиловой кислот; гуаниловые и цитидиловые остатки (на которые приходится 3%) распределены по всей молекуле сателлитной ДНК.
Аналогичные ДНК выделены из тканей многих животных. 7.2.6. Изменения в последовательности оснований. Мутации Изменения в последовательности оснований ДНК называются мутациял!и и могут включать зал!в!ценив, делецию или вставку одного или более оснований. Известны также инверсии или транслокации последовательности оснований. Среди различных видов мутаций наиболее распространено замещение одной пары оснований. Замещение может быть следствием ошибок в спарнванни оснований в процессе синтеза ДНК (гл. 25). Такие ошибки спаривания могут быть вызваны изменением структуры основания, например таутомерным сдвигом от кето- к енольной форме в момент спаривания. Измененное основание может присутствовать либо в матрице ДНК, либо в поступающем для синтеза дезоксярибоиуклеотнде.
Замещение имеет место, например, вследствие способности редкой лактцмиой формы тимина давать пару с нормальной лактам- Ь НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ ной формой гуанина, что превращает пару гуанин — цитозпн в пару аденин — тимин. Некоторые аналоги оснований, например 5-бромурацил, также могут увеличивать частоту замещений, поскольку относительная доля лактимиой формы увеличивается, н поэтому увеличивается степень ошибочного спаривания.
7.2.7. Плотность ДНК Если концентрированные растворы хлорпда цезия центрифуги- ровать в аналитической ультрацентрнфуге при высоких скоростях до установления равновесия между седиментацпей и дпффузией (гл. 5), создается стабильный градиент концентрации СЕС!. Это соответствует увеличению плотности раствора в направлении центробежной силы.
Формируемый градиент плотности пропорционален центробежной силе в соответствии с уравнением др)пг=аыаг, где р — плотность, являющаяся функцией от радиуса г (расстоянне от центра вращения), на †углов скорость и а — константа, зависящая от природы соли. Если раствор СЕС! содержит небольшое количество ДНК, то в условиях равновесия молекулы ДНК собираются в полосы в тех зонах ячейки для центрифугирования, где их плотность и плотность среды равны (изопикничны). Положение ДНК в ячейке может быть установлено по поглощению в ультрафиолетовой области, регистрируемому с помощью фотографии. Точно вычислив градиент плотности раствора вдоль ячейки, можно найти плотность образца ДНК.
Эта техника называется азо77икническптл 7(ентри4угированиети в градиенте плотности. Плавучая плотность ДНК находится в эмпирической завпспмости от содержания 6+С в молекуле: р(г/сна) =! „%О+О,!00 (содержание еа+ С) Это свойство позволяет фракционировать молекулы ДНК по содержанию в них С+С. 7.2.8. Денатурация ДНК Кроме водородных связей поддержанщо жесткой двуспиральной структуры способствуют гидрофобные силы между расположенными «стопкой» пуринами и пирпмидинами.
Реагенты, подобные формамиду и мочевине, которые увеличивают сольватацн7о ароматических ядер молекулами воды, вызывают также денатурацпю ДНК. По аналогии с действием целого ряда реагентов и условий, например кислоты, щелочи, нагревания и низкой ионной силы, изменение структуры ДНК в этом случае можно объяснить тем, что первоначально прочная двуспиральная структура ДНК переходит в денатурированное состояние, для которого характерна гибкая одно- 1. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ цепочечная структура. Для оценки перехода от нативного состояния к денатурированному, как и для определения других свойств ДНК, существует ряд методов.
7.2.8Л. Поглощение в Уф-области Все нуклеиновые кислоты сильно поглощают свет в УФ-области с максимумом -26О нм. Когда нативность ДНК нарушается, наблюдается заметный гиперхромный эффект — увеличение поглощения. Это изменение отражает уменьшение числа водородных связей и отмечается не только для ДНК, но и для РНК и синтетических полинуклеотидов, которые имеют стабилизируемую водородными связями структуру. 7.2.8.2. Оптическое вращение Натнвная ДНК обладает сильным положительным вращением плоскости поляризации света, которое заметно уменьшается прн денатурацин. 7.2.8.3. Внлкостк Растворы натнвной ДНК имеют высокую вязкость, что является следствием наличия относительно жесткой двуспиральной н вытянутой стержнеподобной структуры ДНК.
Разрушение водородных связей приводит к заметному уменьшению вязкости. 7.2Я.4. Влиннне температуры Как отмечалось выше, нагревание образца ДНК в определенной ионной среде вызывает увеличение поглощения в УФ-области н снижение оптического вращения и вязкости, отражая разрушение водородных связей между нитями двойной спирали. Поскольку взаимодействия между основаниями двух цепей коопсратнвны, подобно взаимодействиям между молекуламн в кристалле, упорядоченная спиральная структура разрушается в пределах небольшого температурного интервала„как это происходит при плавлении кристалла. По этой причине денатурацию двухцепочечной ДНК при нагревании часто называют «плавлениема ДНК, а температуру, при которой денатурнровано 50% ДНК,-- температурой плавления Тч,. Препараты ДНК из разных источников имеют различные Т,,„, которые зависят от абсолютных количеств С+С и А+Т (рис.
7.4). Чем выше содержание О+С, тем выше температура перехода между нативной двойной спиралью и одноцепочечной формой 1рис. г, ньклсиноныв кислоты 1Л6 й а. 1,16 и ч а и а и Ю % 1,16 м га Е е п п Ю 1, ГЗ Е 60 66 61 66 166 темперемьра, С Рис. 7.4. Кривые плавления оаразпов ДЫК разного состава. 11!о!!г Р., р.
8, 1п 11. Л Ве11, 3. К. Сгапг (ег16.1, Т1ге 81гггс!пге апй В1оьуп!вез!6 о1 Масго1по1есг11ы, В!ос)геап!са! Ьос!е!у Бутпроь16, № 21, Сапгьг16яе оп!четь!!у Ргеьь, Мезе 1огй, 19621 7.5). Это понятно, так как пары Π— С могут образовывать структуру с помошью трех водородных связей, в то время как пары А— Т могут образовать только две водородные связи* (рнс. 7.2). Определение значений Т„, при использовании для калибровки препаратов ДНК с известным составом позволиет вычислить содержанне О+С и А+Т неизвестной ДНК. Такое определение следует проводить при фиксированной нонной силе и рН, так как эти факторы существенно влияют на стабильность ДНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
