Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_1 (1123309), страница 44
Текст из файла (страница 44)
Значение Т„, можно снизить, добавляя мочевпну — рсагеит, разрушающий водородные связи и препятствугощнй гидрофобным взаимодействиям. Например, в 8 М мочевпне Т„снижается до -20'С. В 95%-ном формамиде ДНК полностью разделяется на две нити при комнатной температуре. 7.2.8.8. Влияние ри Двуспиральная структура ДНК разрушается также при кислых н щелочных значениях рН, при которых на пуриновых и пиримидиновых основаниях могут появляться заряженные группировки. Вблизи рН 12 ионизация енольных гидроксидных групп предотвра- ' Число водородных связей не определяет прочности пары.
Так, 2-ампноаде- нин даст комплекс с тимином с тремя водородными связями„который по прочности сравним скорее с парой А — Т, чем б — С. — Призе нерее. 16 — 1 148 1. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ 0 ч о и 00 ст й и „000 г а ы 100 110 70 Рис. 7.0. Зэеисимость Г~ от содержэиии 0+С. Точки соответствуют обрвэцэм ДНК иэ рээличиыт источииков. [170!у Р., р. 3, 1п: В. Л.
ВеП, Л. К. Сгэп! (едв.), Т11е 81гцс1цге впо В!овуп1пе»10 о! Мвспвпо1еси1ев, Вюсвеп)сэ! 8001е!у 8угпронэ, № 21, СвгпьгЫКе 1Лп1тегв11у Ргевв, 1чечг тоги, 1962.! щает связывание кето- и амнногрупп за счет водородных связей. Аналогично в кислых растворах вблизи рН 2 — 3, при которых протоинруются аминогруппы, спираль разрушается. 7.2.9. Ренатурация ДНК Деиатурацня ДНК вЂ” процесс обратимый. Если ДНК только частично денатурнрована, например при нагревании, то при снижении температуры происходит быстрая реиатурация каждой молекулы ДНК, скорость которой соответствует реакции первого порядка. Если ДНК полностью денатурирована, две комплементарные нити будут реассоцнировать медленно («отжиг» ДНК). Этот процесс включает две стадии: сначала по реакции второго порядка происходит сборка комплемеитарных последовательностей двух нитей, а затем по реакции первого порядка — быстрое их «защелкнванне».
Если начальная концентрация денатурированной ДНК Со (молярная концентрация фосфата ДНК), то изменение концентрации С одноцепочечной ДНК во времени подчиняется уравнению реакции второго порядка г(с/011=Х1С1, интегральная форма кото- т.нуклеиновые кислоты 'число иуилаотииаиых аар Ю 1О* Юи КИ И|и 10а 10т 1Ф Ю' 10Ы ° с Р и и л и. 1,0 Ю"и 10 ° Ю 4 10"» 10"* 01 1 10 100 1,000 10000 осело .
л' Рис. 7.6. Реиатурации ииухцепочелиых нуклеиновых кислот иа рааличиых источ- иикою (ВТВ1ел В уи 7Толле В. Еи $01епсе, 161, 629, 1968.] рого С/Со=!Я1+КОС01) Скорость ренатурации обычно оценивается по графику зависимости С7СО от!яС01 (рис. 7.5). Построив график, можно найти Со1чм где 1171 — время, при котором С/Се —— =0,5, а также константу скорости реакции второго порядка 7(1, 1 равную . Константа КΠ— характерястнческий параметр для с им " данной ДНК; она обратно пропорциональна Л' †чис пар оснований ДНК (если ДНК не имеет повторяющихся последовательностей). СО(170 прямо пропорционально Л7 (Л7 называется сложностью ДНК).
Этот метод позволяет определить для бактернальных и вирусных ДНК значения Л7, согласующееся со значениями, полученными другими методами, 7.2.10. Размер ДНК Молекулы ДНК длинные и неразветвлеиные. Их размер можно охарактеризовать тремя параметрами — длиной, числом нуклеотидных пар и массой. Так, ДНК длиной ! мкм (1Π— ' см) содержит 3000 пар основаикй и имеет массу 2.10" дальтон (ббО дальтон на 1 пару оснований для Ха+-соли).
Первоначально предполагалось„ что ДНК должна быть не длиннее, чем 15000 пар оснований (5 10 ' см), пока не было найдено, что она легко рвется под действием гпдродинамических сил. При осторожной работе„исключающей гидродинамический разрыв, можно выделить значительно более длинные молекулы ДНК (табл. 7.4). 16" Е ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ Таблица 7.4 Размер разлнчных молекул ДНК Стсансс масло пар осноаанна на асса~осаму, , Ю Наело хромосом (гап'онаныа набор) д.
нна, Органнам Форма Вирус 40 15 т'40) обезьяям Бактернофаг 1бх174 О,с0017 О,ООЭ18 5,1 Кольцевая Кольцевая одноценочечная; двойная ренлякатнвнаа Линейная Кольцевая Бактернофаг Х Е. соп Дрожжи Вгозора11а ясе1алоеа" Ист Человек 46 4 000 1 000 41 СОО 0,0015 0,13 О,ЗЗ 1,4 1 1 17 12 э 000 4,1 Длину молекул ДНК, содержащих от 3. 1О' до 3 1О' нуклсотпдных пар, можно измерить непосредственно с помощью электронного микроскопа. Молекулы ДНК с размерами нуклеотидных пар от 2.10' до 2.10' можно разделить на пористых гелях агарозы, используя молекулярно-ситовый эффект. Классическим методом определения размеров ДНК является седиментация в центробежном поле. Скорость седиментапнн молекул пропорциональна силе поля от'г и определяется уравнением с(г1111=зоззг, где о> — угловая скорость и г — расстояние до центра вращения.
Коэффициент седиментации е связан с молекулярной массой ДНК эмпирическим уравнением Е=0,0882 10 —" Ме '"". Определение размера ДНК с помощью цснтрифугирования ограничено областью от 3-10' до 1,8 10' пар оснований из-за гидродинамических разрывов более длинных молекул. Для определения с помощью седиментации размера молекул ДНК, содержащих более 10' нуклеотидных пар, используют новую технику вязкозластичного замедления. В этом случае в раствор ДНК, размер молекул которой измеряют, погружают ротор и очень медленно поворачивают его с помощью внешнего магнитного поля.
Когда магнитное поле выключается, ротор возвращается в первоначальное положение за счет энергии, накопленной в эластично растянутых молекулах ДНК. Скорость, с которой ротор возвращается в первоначальное положение, является функцией молекулярной массы самых больших молекул ДНК в растворе и связана с ней уравнением М=2,2 10'т' '„ где т — время вязкозластичного замедления (в секундах). т находят по уравнению 8(1) — 8(оо) = Т.нуклеиновые кислОты 229 =610)а-тут, Гдс 0 — УГОЛ ПОВОрОта рОтОра, ИЗМЕрЕНИЫй В МОМЕНТ времени 1, оо и О.
Найдено, что длина ДНК в самой большой хромосоме 1згозор7т1- 1а пте1апо71аз1ег, измеренная этим методом, находится в хорошем соответствии с массой ДНК, определенной цитологцческцми методами. Из этих измерений следует важный вывод, что хромосомы животных, подобно бактериальным и вирусным хромосомам, содержат по одной непрерывной ДНК-спирали. Длина молекулы ДНК в самой большой хромосоме человека может достигать 8 см и более. 7.2.11. Топология ДН К Изолированные молекулы ДНК могут быть линейиымп, т.
е. содержать два конца, или циклическими 1табл. 7.4). Однако ДНК обычно существует не в вытянутой форме, а плотно упакована в хромосоме клетки или в головке вируса. Хотя длина ДНК самой большой хромосомы человека может составлять 8 см, она так упа. кована в хромосоме, находящейся в состоянии мнтоза, что ее длина составляет всего 5 нм. Если обе нити циклической двуспиральной ДНК, например ДНК вируса Я140 или реплнкатнвной формы ДНК фага ФХ174, замкнуты, т. е. сахарофосфатная цепь непрерывна, то они могут иметь суперспиральную или суперскрученную конформацшо. Суперспиралнзация имеет место, когда в правовращающей спирали ДНК число пар оснований на единицу длины больше стандартного и, как следствие, образуются отрицательные супервитки 1рис.
7.7). Суперспирализацня может быть нарушена расщеплением одной или двух нитей, например действием дезоксирнбонукле- Рис. 7.7. Схематическое изображение эффектов связывания этидийбромида с ДНК вируса БЪ40. а — молекула ДНК (без красителя) с !4 отрипательпымн супервитками; б — прн связывании 420 молекул красителя супервитки полностью исчезают; а — при дальнейшем связывании 720 молекул красителя молекулы Д11К переходят в состояние с 24 положительными супервнтками. 1даисг 1Р., Шподтат1 Д, з, Мо!.
В!о1., ЗЗ, 141, 1968.] ь основные компоненты клетки 230 азы. Вторым методом является интеркаляция плоских молекул, таких, как этидийбромид, между стопками пар оснований. ьптт Ввилийбромид Интеркаляция одной молекулы этидийбромнда раскручивает суперспираль на 12, так что требуется 30 молекул этидийбромида на один суперспнральный виток. Когда отрицательные суперспиральные витки полностью раскручены, дальнейшее добавление этиднйбромида вызывает появление новых витков суперспирали, но теперь в положительном направлении (рис.
7.7). 7.2.12, Белки, связанные с ДН К У нрокариот (бактерий и сине-зеленых водорослей) ДНК связана с незначительным количеством белка. На каждый межнуклеотидный фосфат ДНК, так же как и РНК, приходится одна анионнвя группа с рК;-1. Следовательно, нуклеиновые кислоты при нейтральных рН существуют в виде солей Ха+, Мдт+ или других катионов. В некоторых бактериофагах и растительных вирусах нуклеиновые кислоты связаны с ди- и полиаминами, такими, как кадавернн, путресцпн, спермнн и спермидин (гл. 22). У эдкариог ДНК находится в таких цитоплазматических органеллах, как митохондрии (гл. 12), хлоропласты (гл.
16), а также в хромосомах ядер. Ядерная ДНК клеток растений и животных соединена с основными белками †гистона, которые связаны с ДНК не ковалентно, а с помощью ионных и, возможно, иных дополнительных взаимодействий. В хромосомах присутствует также небольшие количества кислых белков. Комплекс ДНК с гпстонами, называемый хроматином, может быть выделен из интерфазного ядра.
Этот комплекс содержит ДНК и гнстоны в приблизительно равных количествах. 7.2Л2Л. Гвотоом Этн белки обычно получают экстракцией ядер или хроматина разбавленными кислотамн (0,2 М НС!). Они осаждаются нз раствора щелочами прн рН-10 или путем высалнвання. Разделение 7. НУКЛЕИНОВЫЕ К11СЛОТЫ гистонов на индивидуальные достигается гель-фильтрацией, ионообмениой хроматографией или электрофорезом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
