Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_1 (1123309), страница 31
Текст из файла (страница 31)
Белки. и образуя различные, но в равной мере эффективные адсорбенты для галактознлтрансферазы, катализируюпгей реакцию (гл. 15) )ЛЭР-Сз1+ С1с)чдс — » Ов! (р!,4) Яс)Час+ ЫРР 6 о н и-сн~-(сн )~-с-о — Р-Π—— — т-о — )э- о — сн г'.)н <эн о н н но он ,— (сн,),— сн« вЂ” нн, н ныл« Слетует обратить внимание ня то, что в обоих случаях лнгяна отделен шестью метнленовыми звеньями от амииогруппы, реагирующей с агарозой.
Зги звенья образуют так называемую «ножку», роль которой заключается в том, чтобы отлалнть лиганд от поверхности агарозы с целью устранения стерических препятствий для связывания фермента. Известно много случаев, когда для получения эффективного аффииного адсорбента требовалась даже более длинная «пожла». 5.6.4.
Злектрофорез ! 1 — !!4» Ранее уже отмечалось, что белковые молекулы перемешаются в электрическом поле (при любом рН, кроме изозлектрической точки). Методы, основа нные на этом свойстве белковых молекул, широко используются прн изучение смесей белков. По кривой титрования белка можно составить представление о суммарном электрическом заряде молекулы прн любом рН. Так как скорость перемещения молекулы в электрическом поле в значительной степени определяется ее суммарным зарядом, электрофорстическая подвижность белка зависит от рН, как, впрочем, и степень ионизапии молекулы. На рпс. 5.22 приведены электрофоретнческая подвижность н кривая тнтрования кристаллического яичного альбумина. Хотя форма и размеры молекулы оказывают влияние на абсолютную скорость перемещения в электрическом поле, определяющим фактором является все же суммарный заряд. Поскольку белки значительно различаются по изоэлектрическим точкам н кривым титрования, они различаются также по злектрофоретнческой подвижности при любом данном рН.
Электрофоретнчсский анализ используется для определения чистоты индивидуальных белков, а также для количественного анализа сложных смесей. В экспериментальном отношении злектрофорез довольно несложен. Белок в буферном растворе с определенным рН помещают 1. ОснОВные компоненты клетки йй 2 ют6 йаа 2„.-. о оно й 2 зй ч 6 в о е ч 2 и 12 в ая -4 о 3 4 3 6 7 б Я 10 11 12 РН на дно 13-образной трубки. Непосредственно на образец белка наслаивают буферный раствор, не нарушая границы между ними В буфер опускают электроды, а 11-образную трубку погружают в башо, в которой поддерживается постоянная температура около О'С.
Это делаетсн для того, чтобы уменьшить конвекционные токи, которые могут возникать при выделении тепла, а также для предотвращения тепловой коагуляцни термочувствительных белков. В современных злектрофоретических приборах применяются (3-образные трубки с плоскими оптически прозрачными поверхностями.
Эти приборы сконструированы таким образом, что введение растворов в систему и температурное уравновешивание осуществляются без нарушения границы между буфером и раствором белка. Скорость движения молекул белка в электрическом поле определяется путем измерения временной зависимости перемещения фронта белка в растворителе. За перемещением зоны окрашенного белка можно легко наблюдать визуально. Но поскольку большинство белков бесцветны, разработаны специальные оптические системы, подобные применяемым при ультрацентрифугированни (равд.
5.1.1), позволяющие следить за изменением показателя преломления раствора в электрофоретической ячейке. Эафиксированные различии значений показателя преломления в разных зонах раствора белка отражают изменения концентрации белка; другими словами, градиент показателя преломления связан с распределением и количеством растворенного вещества, в данном случае белка. Рис. 5.22.
Электрофоретическая подвижность (точки) н кривая титровавпя кристаллического яичного альбуиина. (Данные по подвижности взяты из работы (бопнзгвог(Ь б. С.. Апп. (Ч. т'. Асаб. 5с1., 41, 275, 194Ц; кривая тнтрования взята из работы Сапаап 1(. А'., АтЬг(сп А., Ра(гает А. О., Апп, (Ч. У. Асаб. Бс!., 41, 249, 19411.) (бз а. вилки. и 'Рис. 5.2З.
Элекгрофорегическое разделение сложной смеси белков плазмы крови человека (а), одиночный пнк кристаллической карбоксипептидазы (б) и гомогениый пнк кристаллического бычьего сывороточного альбумина (а), Бертнкаль— стартовав граница белкового раствора.
Пик в начальном положении обусловлен присутствием солей буферного раствора. На рпс. 5.23 представлены электрофореграммы двух высоко- очищенных белков (б и в). Там же в качестве примера разделения сложных белковых смесей приведены результаты электрофореза образца нормальной плазмы человека (а). Чистое вещество дает только один симметричный пик, имеющий форму вероятностной кривой.
Асимметричность этой кривой, а также наличие нескольких пиков свидетельствуют о присутствии смеси нескольких веществ. В этом случае можно количественно оценить долю каждого нз компонентов смеси, определяя отношение площади пика данного вещества к сумме площадей всех пиков. Разделение заряженных соединений с помощью электрофореза можно проводить не только в растворе, но и в различных пористых инертных средах, таких, как крахмал, силикагель, полиакриламидиый гель, смоченная фнльтровальная бумага. Раствор смеси веществ обычно наносят в виде четкого пятна или зоны, а затем проводят электрофорез, добиваясь иногда полного разделения всех компонентов смеси. Этот процесс, называемый зонлыдг злектрофоРезоль применяют как для аналитических, так н для препаративных целей. Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия широко используют для определения молекулярных масс полнпептидов (равд.
5.1.7); метод иммуноэлектрафореза рассмотрен в гл. 50. .5.6.5 Критерии чистоты Ранее (разд. 5.6 и след.) уже рассмотрены принципы н приведены примеры использования различных каскадных методов выделения. очистки и количественного анализа компонентов сложных смесей. Эти же методы часто оказываются полезнымн для уста- 164 !. Основиык компоиеить! к3!етки новления степени чистоты веществ.
Обычным критерием чистоты ннзкомолекулярных веществ биологического происхождения является сохранение физических констант и элементного состава после повторных очисток. Хорошие результаты получают прп использовании одного или более «каскадных» методов. Чистоту нпзкомолекулярных ионных соединений можно оценить, например, с помощью зонного электрофореза, ионообменной хроматографии илн хроматографии на бумаге, а иеионных веществ — с помощью хроматографии на бумаге, адсорбционной илп газожидкостной хроматографии. Обычные критерии, принятые для оценки чистоты низкомолекулярных веществ, малоприменимы к белкам, нуклеияовым кислотам и полисахаридам. Эти макромолекулы плохо кристаллпзуются и могут образовывать смешанные кристаллы с другими соединениями; опи, как правило, пе имеют определенной точки плавления.
Определение элементного состава в этом случае не имеет смысла вследствие наличия огромного числа атомов в макромолекулах Однако что касается белков, то число остатков каждой аминокислоты, рассчитанное на молекулу индивидуального белка, должно быть целочисленным; следовательно, когда в молекулу белка входит небольшое число остатков какой-либо аминокислоты. аминокислотный анализ дает ценную информацшо о гомогенности белка.
Непосредственных способов определения чистоты макромолекул не существует; для этих целей используются методы обнаружения примесей, т. е. доказательства негомогенностн образца. Считается, что вещество является чистым„если ни один из возможных методов не выявляет его негомогенность. Для обнаружения примесей прежде всего используются каскадные методы. Гомогенность образца по молекулярной массе может быль установлена с помощью методов ультрацентрифугнрования нлп гель- фильтрации. Но эти методы менее чувствительны по сравнению с каскадными методами, в которых разделение макромолекуч зависит от их суммарного заряда. Для установления чистоты белков, пептидов и олигонуклеотидов очень полезны методы зонного электрофореза, особенно при изучении электрофоретического поведения образца в нескольких буферных системах с различными значениями рН.
С помощью ионообменной хроматографии также можно обнаружить присутствие примесей. Распределительная хроматография и протнвоточное распределение были успешно использованы при изучении лишь немногих белков из-за ограниченной растворимости и относительной нестабильности большинства белков в не- полярных растворителях. Чистоту пептидов, содержащих до 40— 50 остатков аминокислот, можно во многих случаях установить с помощью хроматографии на бумаге.
Часто макромолекулярное вещество, кажущееся гомогенным при исследовании одним мего ом, оказывается негомогенным при использовании другого метода. На- к Белки и пример, по результатам ультрацептрнфугирования присутствующие в растворе молекулы белка имеют одинаковые размеры и форму, а согласно данным злектрофореза, в растворе имеются примеси. При определении чистоты любого вещества следует применять методы, основанные на различных свойствах молекулы, таких, как размер, заряд, растворимость и т.
д. Многие белки обладают специфическими функцноналытыми свойствами: одни являются гормонами, другие — ферментами, третьи — переносчиками кислорода и т. д. Методы обнаружения белков, основанные на их специфических функцпояальных свойствах, являются чрезвычайно чувствительными, поскольку наличие очень небольших количеств таких белков может быть зафиксировано по физиологическому действию, каталитической активности и т. и:, если препарат белка обладает рядом каталитическнх. или других функций, за которые отвечает единственный белок, то дополнительная очистка нли частичная инактивацня белка ие должна изменять соотношения функциональных активностей.
Например, если ферментативный препарат действует на вещество А в 10 раз быстрее, чем на В, а при повторной очистке фермента отношение изменнется от 1О: 1 до 100: 1, то этот факт свидетельствует о том, что за два каталитических эффекта ответственны разные ферменты. Критерий функциональной гомогенности благодаря высокой чувствительности самого теста является одним из наиболее важных прп исследовании белков.
Часто оказывается возможным зафиксировать с помощью теста на функциональную активность наличие примесей, присутствующих в крайне низких концентрациях !одна часть примеси на несколько тысяч илп миллионов частей основного белка). Такая чувствительность намного превышает чувствительность большинства физических нли химико-аналитичесюгх методов. Большинство белков, а также некоторые полисахариды и липпды обладают свойствами аитигенов, т. е. они стимулируют образование специфических антител после инъекции подопытному животному, Инъекция индивидуального вещества вызывает образование антител одного типа, тогда как смесь антигенных веществ вызывает образование нескольких типов антител.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
