Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_1 (1123309), страница 26
Текст из файла (страница 26)
Растворы таких молекул проявляют ярко выраженную способность к рассеянию света, и поэтому форма молекул, а также их молекулярная масса могут быть определены с помо1цью измерения рассеяния света. Вязкость раствора прн данной концентрации растворенного вещества зависит от молекулярной массы и формы молекул этого вещества. Белки, молекулы которых резко асимметричны, обладают большей характеристической вязкостью, чем белки с такой же молекулярной массой, но со сферической формой молекул.
Если известна молекулярная масса, то по изменению вязкости в зава- симости от концентрации растворенного вещества можно оценить форму молекул. 5.3. Амфотерные свойства 1ао ~мом и йей а о м ао а о Фс Рис. 5,7. Кривая титроваиия кристаллического гемоглобииа лошади. 1соап Е д, Огееп А А., В1опсйаго' М, Н., Л. Агп. С11егп. Яос., 99, 990„1937.1 Х 4 6 6 10 1$ рН Белки, как н аминокислоты, являются амфолитамн н мигрируют в электрическом поле со скоростью, зависящей от их суммарного заряда н рН среды.
При определенном для каждого белка значении рН его молекулы оказываются электронейтральными. Это значение рН называют изоэлектричгской точкой н обозначают р7; некоторые типичные величины р1 приведены в табл. 5.1, Изоэлектрическая точка белка зависит от числа и природы заряженных групп в молекуле. Белковая молекула заряжена положительно, если рН среды ниже р1, и отрицательно, если рН среды выше р7.
Число нонизованных групп в белке можно определить с помощью титровання от изоэлектрической точки кислотой или основанием; кривая титрования гемоглобина лошади (рис. 5.7) типична для глобулярных белков. В табл. 5.2 приведены характерные значения рК нонизованных 1с-групп белков. Точное значение рК отдельной ионпзованной группы данного белка может несколько отличаться от значения, указанного в табл. 5.2 и зависящего от электростатического окружения этой группы.
Например, каждая из у-карбоксильных групп белка может иметь несколько отличное от других значение рК но вместе этн группы дают при титраванни кажущееся значение рК, приблизительно равное 4,4. Влияние локального окружения проявляется в экстремальных значениях рК !.
ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ 188 Гиблици 6.2 Характерные знкчеиия рн кислотных и основных групп белнон Энетренааьные аначенн» рк рк птн З! С ГРуппа некоторых ионизованных Я-групп, которые также приведены в 'табл. 5.2. Как амфолиты, белки связывают и катионы, и анноны. Специфическое связывание белками небольших ионов, например иона Са'+, играет важную роль в физиологических процессах. Некоторые органические и неорганические вещества легко осаждают белки нз растворов. К таким веществам относятся трихлоруксусная, пикриновая, фосфовольфрамовая кислоты, а также ионы тяжелых металлов, такие, как Нда+ и Ваз+. Многие нативные белки являются металлопротеинамн (коньюгированнымн белками); онп специфически связаны с ионами Сцз+, л.пз+, ген+ и гез" в координационные комплексы с участием различных ионизованных групп. 5.4.
Растворимость Каждый белок обладает определенной растворимостью, зависящей от природы самого белка н состава растворителя. На растворимость существенное влияние оказывает рН среды. Обычно растворимость минимальна в нзоэлектричсской точке (рис. 5.8). Вераятно, это происходит вследствие того, что в пзоэлектрической точке силы электростатического отталкивания минималы!ы, а силы, способствующие формированию кристаллической реи1еткп, максимальны. При отклонении рН в любую сторону от р1 белки приобретают положительный или отрицательный заряд, а пх растворимость увеличивается.
Присутствие солей в растворе может либо увеличить, либо уменьшить растворимость белка. Увеличение растворимости бел- а-Кзрбокснльнзя (конпевзя) ()-Кзрбокснльняя (зсцзрзгвновзя кислоте) т-Кврбоксильнзя (глутпминовзя кислота) Имидззольнзя (гистидин) а-Аминогруппв (концевая) е-Аминогруппн (лизин) тузннднновня (зргиннн) арекольныа гидрокснл (тнрозин) Сульфгидрнньнзя (цветени) З,Π— 3,2 З,Π— 4,7 4,4 5,6 — 7,0 7,6 — 8,4 9,4 — 10.6 11,6 — 12,6 Ч,6 †,4 8 — 9 1 — 6,8 1 — 6,8 1 — 6,8 6,6 — 7 5 7,3 — )! 2 7, З вЂ” ~12 11,6 — 12,6 9,4 — а1 2 8 — 9,6 1ЗО ь. велим.
и Рис. 5.8. Растаоримость 5-лактоглобулина а зааисимосги от РН среды ори четырех различиык зиачеиияк ионной силы. 3 "г Е 3 я \ о лв ь,о ьг ь,ч ь,ь ь,ь тн ков в присутстиии солей называют солевым растворением (рис. 5.8). Растворимость является функцией ионной силы раствора, которую, зная молярную концентрацию и заряд присутствующих ионов, легко рассчитать по уравнению Р = т1, ~ч„'млт где 1ь — ионная сила, лт — молярность, а 2 — заряд нона. Знак суммирования Х означает, что величины глаз, соответствующие каждому иону, складываются. Ионная сила растворов солей однозарядных ионов равна их молярности, а ионная сила, например, 0,1 М раствора ИааБОч равна н= у,1о,й.1ь+о.1 й)=.о,з Растворимость любого вещества зависит от относительного сродства молекул растворенного вещества друг к другу (по типу сродства при образовании кристаллической решетки) и к молекулам растворителя. Любой фактор, снижающий взаимодействие молекул растворяемого вещества, будет способствовать его растворению.
При солевом растворении малые ноны нейтральных солей взаимодействуют с ионными группами белковых молекул, сниэкая тем самым белок-белковое взаимодействие и, следовательно, увеличивая растворимость. Высокие концентрации нейтральных солей приводят к осажденшо белков из водных растворов. Это явление называют высаливаацем. Двух- и трехзарядные ионы более эффективны в этом смысле, чем однозарядные 1рис. 5.9). Обычно для высаливания использу|от Р)агЬОь (МИч)гЗОм соли магния и фосфаты.
Высаливание Г. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ наиболее эффективно, и изоэлектрической точке белка. Влияние ионной силы на растворимость карбоксигемоглобина показано на рис. 5.9. Высалнвание может происходить не только в случае с белками, но также и с газами, незаряженными молекулами н электролятами.
Механизм этого процесса сложен. Ионы соли притягивают поляризованные молекулы воды, уменьшая тем самым количество воды, взаимодействующей с белком, поскольку при высоких концентрациях солей количество ионов соли огромно по сравнению с заряженными группами белков. Л так как растворимость белков в воде зависит от образования гидратной оболочки вокруг гидрофильных ионных групп, перемещение молекул воды к другим ионам снижает растворимость белка. Влияние солей на растворимость белков и аминокислот в качественном отношении аналогично.
Белки осаждаются также из водных растворов неполярнымп растворителями, смешивающимися с водой, С этой целью обычно используют метанол, этанол н ацетон. На растворимость белков в этих растворителях существенно влияют нейтральные соли.
Наиболее удовлетворительных результатов достигают тогда, когда нсе операции проводят при низких температурах, т. е. в условиях, при которых белки наиболее стабильны. 5.5. Очистка белков Многие методы очистки белков принципиально подобны методам, применяемым для очистки других веществ, представлягощих биологический интерес. Однако одно пз основных требований, хг цв й О.4 н -04 х о а -аа Š— 1,2 — 1,6 — г,о 1 2 3 4 З 6 кеннан сила Рис.
5.9. Растворимость карбоксигемоглобина лошади в соленых растворах различной ионной силы. Имеет место квк соленое растворение, так и высалиаание. 1Сойп Е. Х., ЕгЬа11 А Т., Рго1е1пв, Апппо АсЫа, апб Рер1Ыев ав 1опа апб й1ро1аг 1опв, Яе1пиоЫ РпЫ1аЫпд Согроганоп, Хечг Уог1с. 1942.1 к велки. и 141 предъявляемых к такого рода методам, заключается в необходимости переведения изучаемого белка в раствор.
Даже если известна детальная структура белка. точно предсказать его растворимость невозможно. Вот почему подбор условий очистки белков производится во многом эмпирически, а растворение, являющееся первой стадией очистки, может быть достигнуто только путем опробывания известных методик. Обычно при этом поддерживают температуру около 4'С и стараются избегать экстремальных рН, хотя известны и исключения. Многие белки, присутствующие в различных клеточных структурах, могут образовывать ассоциаты с другими веществами, например с липидамн, превращавшими эти белки в нерастворимые в воде. Исходную ткань измельчают, добиваясь разрушення клеток н обеспечивая тем самым наиболее полное проникновение в них растворителя. Белки часто экстрагируются водой пли растворами солей с небольшой ионной силой.
Онн также могут быть солюбилизированы с помощью слабых растворов летергентов, а также с помогцью пеполярных растворителей, например ацетона или эфира, удаляюших лнпиды, пла бутанола, разрушающего клеточные структуры. Для дальнейшего разделения растворенных белков часто используют различия в нх растворимости. Большие количества балластных белковпли выделяемый белок можно осадить пз раствора путем изменения условий, влияющих на растворимость, а именно концентрации солей, рН илп концентрации органического растворителя. Часто оказывается эффективным ступенчатое увеличение концентрации (ХН4)зЗО4.
Глобулярные белки растворимы в 1 М (25% концентрации насышенного раствора) ((чН,)зБО4 и осаждаются при увеличении концентрации этого раствора до 5,3 моль/л (насышенный раствор). Можно подобрать такую концентрацию соли (например, 40а(, концентрации насыщенного раствора), при которой выделяемый белок еше находится в растворе, в то время как другие белки, нерастворимые в этих условиях, осаждаются и могут быть отделены центрифугнрованием. Затем концентрацию соли увеличивают (например, до 609р концентрации насышенного раствора) с тем, чтобы нужный белок выпал в осадок, а другие белки остались в растворе. Далее выделяемый белок может быть подвергнут очистке другими методами (описанными в последующих разделах), применяемыми для выделения многих других веществ биологического происхождения.
5.6. Методы разделения и очистки биологически активных веществ традиционные методы органической химии, такие, как перегонка, кристаллизация и возгонка, неприменимы для очистки большинства компонентов живой материи, и поэтому для них были раз- 1 ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ 142 работаны специальные методы. Проблемы, с которыми приходится сталкиваться при выделении чистых биохимических компонентов, будут рассмотрены ниже. Вещество, подлежашее очистке, должно быть отделено от других компонентов смеси, которая обычно содержит несколько тысяч различных видов молекул, имеющих молекулярную массу от 1О' до 10' и присутствующих в концентрациях от 10 —" до 10 ' моль1л. Выделяемые вещества зачастую неустойчивы; поэтому их не следует подвергать воздействию рН, температуры или давления в нх экстремальных значениях.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
