Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_1 (1123309), страница 25
Текст из файла (страница 25)
Из уравнения следует, что чем больше молекулярная масса белка, тем ниже осмотнческое давление 1в пересчете иа 1 г вещества). Однако в действительности метод не применим к белкам с молекулярной массой, превышающей несколько сотен тысяч. На осмотическое давление сильное влияние оказывают заряд белка и кои.
центрапня электролитов буфера. Вследствие того, что молекула белка заряжена, а по обе стороны мембраны должна поддерживаться электроиейтральностгч концентрации диффундирующнх ионов па разные стороны мембраны могут различаться, что будет влиять на осмотнческое давление. Однако этими эффектамн можно пренебречь, если осмотическое давление намерять в изоэлектрической точке белиа или же при значениях рН, отличающихся от нзоэлектрической точки, но прн высоких концентрациях электролитов.
В настоящее время измерение осмотнческого давления с целью определения молекулярной массы используется редко. Экспериментально наблюдаемое осмотнческое давление отражает среднюю молекулярную массу всех белков, присутствующих в растворе. Такнл1 образом, только для чистых белков можно ожидать получения истинных значений молекулярной массы. В противоположность другим методам, имеющимся сейчас в распоряжении, этот метод совершенно ие дает яредставления о гомогенности исследуемого препарата белка.
5.1.5. Определение молекулярной массы белков иа основании их состава Минимальная молекулярная масса М,„любого соединения может быть рассчитана из его элементного состава. Этот прием не применим для белков„ состоящих из множества атомов С. Н, Х и О. Однако минимальные молекулярные массы некоторых белков, содержащих небольшое число атомов какого-либо элемента, могут быть установлены точно. Например, гемоглобин содержит 0,341в железа (атомная масса железа 66,6). Минимальная молекулярная масса, рассчитанная по формуле атомная масса Х 100 Мю1я содержание элемента в масс. зй равна !6700. Для гемоглобинов такие значения были получены Вочтн !00 лет назад; они послужили первым указанием па то, что молекулы белков крупнее, чем молекулы других органических соединений, известных в то время.
Определенная позже действительная молелулярная масса гемоглобина оказалась равной 66000, т. е. молектла гемоглобина содержит четыре атоиа железа. з. Белки. и 133 Мьы может быть рассчитана подобным же образом, всходя нз содержания остатков амннокнслот, прнгутствуюшнх в белке в неболыпнх колнчестнах. Например, бычий сыаороточный альбуынн содержит 0,58Ъ трнптофана (молекулярная масса трнптофана 204,231. Отсюда М и для этого белка равна 36 200, что составляет около лоловнны действнтельной молекулярной массы, равной 69 000. Часто, однако, молекулы белков вообще не содержат таких редких атомов нзн амннокнслотных остатков, которые можно было бы испольэовать для определения молекулярной массы.
В этом случае целесообразно применение фнзнческнх методов 5.1.6. Фильтрация на молекулярных ситах Определение молекулярных масс белков возможно также с помощью колоночной гель-проникающей хроматографии на полисахаридных или полиакриламидных гелях с поперечными сшивками (равд. 5.6.3.4). Этот метод, названный гель-фильтрацией, позволяет производить оценку гомогенности по размерам молекул, а также разделять белки с различными молекулярными массамн. Зная объем элюирования изучаемого белка, можно оценить его величину, если колонка предварительно прокалибрована по белкам с известными молекулярными массами. На рис. 5.5 приведен график зависимости объемов элюирования Р, различных белков от их молекулярной массы (молекулярные массы — в логарифмической шкале). Значения молекулярных масс большинства белков хорошо укладываются на приведенной на рисунке пологой кривой.
Исключение составляют лишь некоторые белки с ярко выраженной асимметричной формой молекул, например фибриноген и овомукоид. Таким же методом (рис. 5.5), но с использованием в качестве элюента 6 М гуанидингидрохлорида, можно довольно быстро определять молекулярные массы субъсдиннц белков. В этом растворе молекулы белков полностью теряют свою конформацню (гл. 6). и, таким образом, форма молекул не влияет на правильность определении молекулярной массы, как это имеет место в случае гельфильтрацин натнвных белков. Отметим, что, прежде чем приступать к анализу белка данным методом, следует восстановить дисульфидпые связи.
5.1.7. Гель-электрофорез и гель-фильтрация в присутствии додецилсульфата натрия Белки под действием детергента додецилсульфата натрия (ДСН) денатурнруют и диссоцинруют на субъединицы. Инкубация белка в растворе ДСН при 100'С в течение нескольких минут приводит к разворачиванию белковых молекул и связыванию с ними молекул ДСН (примерно одна молекула ДСН на каждые два аминокислотных остатка). Образовавшиеся комплексы содержат 1,4 г ДСН на 1 г белка. Алифатические додецильные группы Ф Ф о Х й И.: 3 оо ок ой оо оо. ко ох мо щ \ ф Я Р о о о о Ю О Ф Ф о о у О> ко оо о о~о ФоО' М ЬЪ о о о юэ д Юз о о.Р, оо~ ойдо ооо 1о о~ з 3 о ой, О Ы~~ м В оиъ ~~ =,=о "х.с Р м о о~ ах о о и ь~о о о~ ~".м й Ю ХР оооо о 03 о'~ омй о.о о с~ ф ~ою око о о~" о Ыо Р оЮ юО о о м Ф щ оо о Сб ~ о юО «» ° о С3, о 1' ао 125 э.
Белки. !г ынезнн !266606) Д666$ Йвчай емаеамвочный альаимэм (ваеео) многааавв !71266) " ннввхзмв' 414146))'.— 1 ОД 0.4 С,в ЦЭ ЬП б Поаенанасть Рнс. 5.5. Раэделенне смесн белков электрофорезом в полнакрнламндном геле в прнсутствнн ДСН. а — элсктрофорез смеси белков в фосфатном буферном растворс !рН 7,2), содержащем 0,2с)э ДСН; белки двигались сверху вниз; после электрофореза для обнаруженнн белковых зон гель окрашен красителем брнллнантовым голубым Кумассн. Наэванне белка н его молекулярная масса указаны около соответствующей зоны.
б — подвнжносгн 24 белков (относнтельно подвнжностн красителя, прннятой за !) прн ДСН-электрофорезе в полнакрнламндном геле в эаввснмостн от молекулярной массы (от 1! 700 до ба ООО). "наибольшей подвижностью обладает пнтохром с, а нанменьшев — сывороточный альбумнн )В"еЬег К., ОзЬогп М., р. 180, !и Ыепга))э Н., Н1!1 й. 1., ебз., Тье Рго!ешз, чо!. и, 7эсадеппс Ргеэз, 1пс., Ысэг Уогк, !975.) располагаются внутре комплекса, тогда как сульфокислотиые — на поверхности. Суммарный отрицательный заряд такого комплекса намного превьппает заряд боковых цепей аминокислотиых остатков белка. Комплексы ДСН вЂ” белок имеют палопкообразиую форму с диаметром - ),8 нм и длиной пропорциональной молекулярной массе полипептидной цепи.
И такие комплексы обладают примерно одинаковым отрицательным зарядом, приходящимся на единицу массы, и, следовательно, при зональном электрофорезе 1разд. 8.6.4) в гелях с однородной пористостью мигрируют со скоростью, обратно пропорциональной молекулярной массе. Ни явчмзй альзйыян !42666) Ринезаяьдатэеьаэммь, ввэ-лэгьлэегммм! <азееог нагаемэгнвувза Оавппа) сР 4 б хз Й й 2 и 1. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ рис.
5.6 приведен типичный образец геля, на котором с помощью электрофореза было проведено разделение смесн белков, а также дана логарифмическая зависимость подвижности от молекулярной массы. Если в белках нмеются дисульфидные связи, то их следует предварительно восстановить. Некоторые белки, например белки с высоким содержанием углеводов, прн анализе данным методом ведут себя аномально.
Метод имеет также широкое првмененне для оценки сложных смесей мембранных белков и определения их молекулярной массы, поскольку мембранные белки, например белки мембран эритроцитов, плохо растворимы 1гл. 32). Кроме того, молекулярные массы белков можно определять с помошыо гель-фильтрации, подобно тому как описано выше 1рис. 5.5), но используя в качестве растворителя водный раствор ДСН.
5.2. Форма белковых молекул Зная константу седиментации и коэффициент диффузии Р, можно рассчитать величину относительного трения ГЯ =!О ~1(1 — щЯВтьи)) ~~ где все обозначения совпадают с введенными выше (равд. 5.1.1). Величина 1о представляет собой молярный коэффицяеит трения компактной сферической н иегидратированной частицы. Прн Яо= =-1,0 форма молекулы близка к негндратированной сфере. При Я,~ 1,0 молекулы могут быть гидратнрованы или асимметричны или одновременно и гидратированы, и асимметричны.
Молекулы многих глобулярных белков, по-видимому, имеют сферическу1о нли близкую к сферической форму. К таким белкам относятся рибоиуклеаза, инсулин, хнмотрипсииоген, пенсии. Однако молекулы многих других белков явно асимметричны н существуют в растворе в виде вытянутых эллипсоидов или палочек. Белок плазмы крови— фибриноген, явля1ощнйся предшественником фибрина прп образовании тромба, а также мнозии, основной белок мышечных волокон, представляют собой вытянутые эллипсоиды. Установлено, что молекула фибриногена человека имеет в поперечнике 3,8 нм, а ее длина составляет 70 нм.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
