Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_1 (1123309), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Однако ! связан с коэффициентом диффузии !) (См'(с): О =- Йт41 яде )à — газовая постоянная (8,31 ° 1О' эрг.моль — 'град — ')„а Т— абсолютная температура в кельвинах. Таким образом, для молетГулярной массы получаем И= йтР(1 — ) В этом уравнении все величины могут быть определены экспери.ментально, и, следовательно, можно вычислить молекулярную массу.
Коэффициент седиментации з имеет размерность времени, рассчитывается на единицу силы и обычно составляет 1 ° 10-"— 200 10 " с. Единица измерения коэффициента седимеитации называется сведбергом (сокращенно обозначается $); 15=! ° 10-" с. Коэффициент диффузии можно определить путем наблюдения ла уширеннем первоначально резкой границы между раствором белка и растворителем по мере того, как молекулы белка диффундируют в зону растворителя. Скорость седиментации зависит от разности плотностей растворенных частиц и растворителя. Если частицы имеют меньшую плотность, чем растворитель, они всплывают (как сливки в сепараторе). Парциальный удельный объем о для большинства белков составляет 0,70 — 0,75 мл/г н зависит от аминокислотного состава; ц можно вычислить, если последний известен, или определить экспериментально.
з. Белки. и 129 Рис. б.з. Седиментацня кристаллической рибонуклеазы в аналитической ультра- центрифуге при скорости вращения ротора 59 780 об!мин. Направление седимеитации — слева направо. Первая фотография сделана через 1 ч после достижения установленной скорости; последующие — через каждые 16 мин. Обратите внимание на то, что по мере продвижения границы ко дну ячейки, высота пика уменьшается, а щнрина увеличивается. Эта явление обугловлено диффузией. Граница у дна ячейки соответствует осажденному белку.
Если препарат содержит смесь белков или других веществ, молекулы которых различны по размерам, наблюда- ется серия пиков. Белки с высокой степенью очистки образуют индивидуальные пики прн ультрацентрнфугировании. В качестве примера на рис. 5.3 приведены кривые седимеитации, полученные с помощью шлиреи-оптики. Ультрацентрифугнрование является полезным при изучении стабильности белков, так как в различных условвях, например прп экстремальных значениях рН или температуры, может происходить агрегация илн диссоциация, что легко обнаруживается по изменению коэффициента седиментацип. В табл. 5.1 приведены молекулярные массы некоторых белков, полученные с помощью седиментациопного анализа.
Современные методы позволяют определять молекулярные массы с погрешностью, не превышающей 57з. 5.1.2. Метод седиментационного равновесия На практике коэффициенты седиментацнп можно определить достаточно точно. Определение же коэффициентов диффузии гораздо более трудоемко. Поэтому метод седиментационного равновесия, который не требует определения коэффициента диффузии, намного удобнее и более широко используется для установления молекулярных масс белков. В этом методе ультрацентрифугирование продолжают до тех пор, пока не будет достигнуто равновесяое распределение изучаемого белка по всей длине ячейки, При равновесии не происходит видимого перемещения белка в ячейке, поскольку его движение ко дну ячейки под действием центробежной силы полностью уравновешивается движением вверх, обусловленным диффузней.
Такое равновесное распределение характерно для каждого белка и зависит от его молекулярной массы. После достн- 9 — 1 149 Ь ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТЮ! 1ЗО женин равновесыя можно измерить концентрацию белка по всей длыне ячейки, используя оптическую систему, описанную выше для определения скоросты седиментации. Уравнение для расчета малекулярной массы по методу седиментацнонного равновесия имеет следующий вид: И1Т!и с М=— в'-х1 (1 — с111 где й, Т, ы', о и р уже определены выше, а с — концентрация белка на расстоянии х от осп вращения в ячейке ультрацентрифугп.
Преобразуя это уравнение, получаем 1и с =. М (1 — юр) ш-'хА,'2КТ График зависимости !и с от х' — прямая, наклон которой равен М(1 — ор)ыЧ2ГтТ. Поскольку с, х, о, р, оР, )т и Т легко измерить или рассчитать, М можно определить по наклону построенной прямой. Кроме того, молекулярная масса может быть рассчытана непосредственно для любой концентрации и соответствующего значения х, и если рассчнтанное значение сохраняется постоянным в любой точке графика зависимости 1и с от х1, то можно считать исследуемый белок гомогенным.
В протывном случае (белок гетерогенен) зависимость !пс от х' не лииейна. Преимуществом описанного метода является также то, что для анализа можно использовать очень небольшие концентрации белка. 5.1.3. Седиментация в градиенте сахаровы Принципиально возможно определение коэффициентов седиментацин и, следовательно, приблизительных л1олекилярных мосс даже не вполне индивидуальных белков, если имеется подходящий метод для измерения относительных концентраций белков, например путем измерения их ферментативнай активности. Изучаемый образец осторожно наносится на раствор сахарозы с линейным градиентом концентрации и подвергается высокоскоростному центрифугированию в роторе с откидывающимися пробирками (в бакет-роторе). Обычна в качестве стандарта в раствор добавляется белок с известным коэффициентом седнментациы з.
Вещества с разлнчнымн седиментационными свойствами отделяются в градиенте плотности друг от друга, образуя полосы. По окончании центрифугироваиия в нижней части центрифужной пробирки проделывают небольшое отверстие, фракции сливают и анализируют. Если фракции отбирают через различные промежутки времени центрифугирования, то временная зависимость расстояния от меннска до зоны белка, обладающего активностью, должна быть линейной. Для данного времени центрифугирования соблюдается следующая б. БЕЛКИ. П Рис.
5.4. Схема простого асмометра. Осмотическое даиленне определяется разностью между высотой столба буферного раствора (л) и высотой столба раствора белка (й) в капилляре. ресмвар белка бичиткик раггкеер приблизительная закономерность, справедливая для веществ с почти сферической формой частиц н близкими значениями и (в качестве стандарта используется белок с известным коэффициентом седиментацпи х): расстояние от меииска до зоны неизвестного белка расстояние от мениска до зоны белка-стандарта„ а., неизвестно~о белка М неизвестного белка )а/л а.„, бельа-стандарта ( г~4 белка-стандарта 5Л.4. Осмотическое давление Полунронипаемые мембраны, изготовленные нз таких материалов. ьак коллодий нтп целлофан, имеют поры, пропускающие молекулы воды н другие небольшие молекулы, но не пропускающие макромолекулы. таким образом, если белок в буферном растворе поместить в мешочек из полупронипаемой пленки, а последний в свою очередь опустить в буферный раствор (рис.
5.4), то молекулы воды н буфера (ио не молекулы белка) будут свободно проходить через мембрану как внутрь мешочка, так и из него. Вследствие нзличия молекул белка конпентрапня (нли, точнее, термодинамическая активность) молекул воды различна по разные стороны мембраны и перемещение молекул воды внутрь мешочна идет лучше, чем в обратном направлении. Этот пропесс будет продолжаться до тех пор, пока эффективные конпентрапин воды по обе стороны мембраны не вйравняютсн. В приборе, показанном на рис 5.4, жидкость поднимается по капилляру. соединенному с диализным мешочком. Ослюгическое давление, т. с.
сила, заставляющая жидкость подниматься вверх по трубочке, измеряется такой высотой столбика жидкости в капилляре, которая достаточна для коипснсапни стремления раствора белка вытолкнуть присутствующие соли 1. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ !32 через мембрану н поднять столбик жидкости выше. Осмотическое давление— свойство раствора в целом, оно является функцией обще~о числа растворенных частиц !ионов илн молекул) в единице объема, ио не зависит от нх природы. Это снойство присуще раствору независимо от того, ограничен ои полупронипаемой мембраной нлн нет. Измеряемое экспериментально осмотическое давление в каждом частном случае зависит от свойств используемой мембраны.
Осмотическое данление связано с молекулярной массой частиц следующим уравнением !которое аналогично уравнению сгютояния идеального газа): ЕУ= —, — ЯТ й М где и — осмотическое давление в атмосферах !1 зги=760 мм ртутного столба), У вЂ” объем раствора белка в литрах, е — масса белка в граммах, М вЂ” молекулярная лхасса, Н вЂ” газовая постоянная (0,062 л атм .град-'моль-') и У вЂ температура в кельвииах. Приведенное выше уравнение справедливо только в случае бесконечного разбавления, поэтому измерение проводится прн нескольких концентрациях белка и М получают экстраполяцией к бесконечному разбанлению.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
