Biokhimia_cheloveka_Marri_tom_2 (1123307), страница 9
Текст из файла (страница 9)
А. Ферментные дефекты и их последствия при оротовой ацидурии типа 1, которая характеризуется недостаточностью двух ферментов — оротат-фосфорибозилтрансферазы и оротиднлат-дскарбохсилазы. Е. Недостаточность оротндилвт-декарбоксилвзы„приводящая к оротовой ацидурии типа П. Пунктирные линии со знаком минус показывают пути ингибирования по принципу обратной связи в нормальных условиях. При оротовой ацндурии типа 1 с мочой зкскретируется оротовая кислота. При оротовой ацидурни типа 11 в роли зкскретируемых соединений выступают оротовая кислота и оротидин. Аббревиатуры расшифрованы на рис.
35.15.(Кедгатуп апй гергодцссд, ~уцЬ рсгпиыюп, Ггош ЯптйЬ 1.. Н. 1г. Руп'- пигйпе шегаЬо11хгп 1п шап. 1ч'. Еп81. Мед. 1973, 288, р. 7641. кислоты. Более того, образующийся необычный нуклеотид подавляет оротидилатдекарбоксилазу, вызывая тем самым оротовую ацидурию и оротидинурию. Однако путь биосинтеза пиримидинов, по крайней мере у человека, «приспосабливается» к такому ингибированию, и «пиримидиновое голодание» имеет место только на ранних стадиях лечения препаратом. 6-Азауридин после превращения в 6-азауридилат функционирует как конкурентный ингибитор ОМР- декарбоксилазы, что приводит к увеличению зкскреции оротовой кислоты и оротидина. При специфическом поражении митохондрий клеток печени (синдром Рейе) имеет место вторичная оротовая ацидурия. Дело в том, что пораженные митохондрии оказываются неспособными утилизировать карбамоилфосфат, который, как и в случае наследуемой недостаточности орнитинтранскарбамоилазы, вызывает избыточное образование оротовой кислоты. Глава 36 Технология рекомбинянтных ДНК Дарил Греннер ВВЕДЕНИЕ ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА ДНК Структура ДНК БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ Технология рекомбинантных ДНК, чаще называемая генной инженерией, революционизировала биологию и оказала огромное влияние на клиническую медицину.
До разработки методов рекомбинантных ДНК наследственные болезни человека изучали с помощью анализа родословных и исследуя аномальные белки. Однако во многих случаях, когда конкретный вид генетического повреждения установить не удается, эти подходы оказываются малоэффективными. Новая технология позволяет адресоваться за нужной информацией непосредственно к молекуле ДНК. В настоящей главе рассмотрены основные концепции, на которых базируется технология рекомбинантных ДНК, ее применение в клинической медицине. В конце главы помещен краткий словарь-справочник. Разобраться в сути технологии рекомбинантных ДНК важно по нескольким причинам.
1. Информационный взрыв в данной области поистине головокружителен. Для того чтобы следить за исследованиями в этом направлении, необходимо усвоить фундаментальные основы генной инженерии. 2. В настоящее время разработана стратегия изучения молекулярной природы ряда заболеваний, таких, как наследственнаягиперхолестеролемия,муковисцидоз, талассемия, хорея Гентингтона, серповидноклеточная анемия. 3, С помощью методов генной инженерии можно получать белки человека в количествах достаточных для терапевтических целей (инсулин, гормон роста, активатор плазминогена). 4. Генная инженерия открыла новые возможности получения белковых вакцин (белки вируса гепатита В) и белковых препаратов для диагностических целей (СПИД и др.).
5. Технология рекомбинантных ДНК оказалась эффективной для решения диагностических задач и при установлении степени риска развития ряда заболеваний. б. Появилась принципиальная возможность осуществления генной терапии таких заболеваний, как серповидноклеточная анемия, талассемия, недостаточность аденозиндезаминазы и др. Такой подход был, например, уже реализован в экспериментах на мышах (наследственный гипогонадизм удалось скорректировать с помощью инъекции в оплодотворенную яйцеклетку гена гонадолиберина). ДНК представляет собой биополимер сложной структуры, организованный в двойную спираль. Ее основными элементами являются пуриновые (аденин и гуанин) и пиримидиновые (тимин и цитозин) основания. Эти основания присоединены к атому С-Г углевода (дезоксирибозы).
Сами углеводные остатки соединены между собой по 3'- и 5'- положениям фосфодиэфирными связями (рис. 37.1). Чередующиеся остатки дезоксирибозы и фосфатные группы образуют остов двойной спирали (рис. 37.2). Направление связей 3'- 5' определяет ориентацию данной цепи, и, поскольку ориентации двух комплементарных цепей противоположны, их называют антипараллельными. Принцип комплементарных взаимодействий пар оснований (принциП спаривания оснований) лежит в основе построения и функционирования молекул ДНК.
Аденин всегда образует пару с тимином, а гуанин с цитозином. Эти пары оснований называются комплементарными. Содержание остатков гуанина в любом фрагменте ДНК всегда в точности соответствует содержанию цитозина. Так же равны друг другу количества аденина и тимина. Две цепи ДНК удерживаются друг возле друга за счет комплементарных взаимодействий пар оснований и гидрофобных «стэкинг»-взаимодействий. Эти взаимодействия могут быть нарушены при нагревании, приводящем Зб Глаеа Зб к денатурацни (плавлению) ДНК. Законы образования пар предсказывают, что при ренатурации две комплементарные цепи ДНК должны вновь соединиться с образованием исходной структуры.
Это и происходит в действительности при медленном остывании (отжиге) раствора ДНК, подвергнутой тепловой денатурации. По температуре денатурации — ренатурации можно оценить степень комплементарности нуклеиновых оснований в цепях ДНК. Для денатурации сегментов ДНК, характеризующихся высоким уровнем комплементарности. требуются соответственно большие затраты энергии. Расхождение цепей таких фрагментов ДНК происходит соответственно при более высокой температуре. Это физическое явление используется на практике для определения степени сродства (гомологии) различных нуклеиновых кислот и лежит в основе метода гибридизации (одного из главных в генной инженерии). Гаплоидный набор человека состоит примерно из 3.10» пар нуклеотидов (п.н.).
Если размер гена в среднем равен 3000 и.н., то, допустив, что гены не перекрываются, а транскрипция идет лишь в одном направлении, можно вычислить, что геном человека включает до 10' различных генов. Считается, что их в геноме человека не более 10' и лишь 1О'Ь геномной ДНК непосредственно кодируют белки. О функциональном значении остальных 90'/» известно крайне мало. Двойная спираль упакована в компактную структуру, образованную за счет взаимодействий с целым рядом белков (главным образом основного характера), называемых гистоиами. Такая компактизация может выполнять регуляторные функции и имеет также определенный «практический смысл». Дело в том, что ДНК ядра клетки при полном расплетании достигает длины 1 м.
Хромосомные белки упаковывают гигантскую молекулу в ядро обьемом всего лишь в несколько кубических микрон. Организация гена Как правило, прокариотические гены состоят из небольшого регуляторного участка (100 — 500 п. н,) и большого кодирующего белок сегмента (500— ! ОООО и. н.). Часто несколько генов контролируются одним и тем же регуляторным элементом. Большинство генов млекопитающих имеют более сложную структуру. Кодирующие области эукариотических генов прерываются и чередуются с некодирующими участками. Эти участки, будучи транскрибированными, удаляются в процессе созревания первичного транскрипта. Кодируюшие области (остающиеся в зрелой мРНК) называются экзоиами. Нуклеотидные последовательности ДНК, находящиеся между экзонами, называются иитронями (рис.
36.1). Интроны удаляются из первичного транскрипта до того, как происходит перенос РНК в цитоплазму. Процесс удаления интронов и сшивания (лигирования) значащих участков получил название «силайсияг РНК». Неправильный сплайсинг может стать причиной болезни человека (см. ниже), что указывает на важность этой посттранскрнпционной стадии. Регуляторные области эукариотических генов обычно располагаются с 5'-конца от точки инициации траскрипции (5'-фланкирующая последовательность ДНК).
Иногда регуляторные последовательности находятся внутри самого гена или даже в 3'- фланкирующей области. В клетках млекопитающих каждый ген обладает собственным регуляторным элементом. Многие гены эукариот (а также некоторых вирусов, рсплицируюшихся в клетках млекопитающих) содержат специальные участки ДНК, называемые «энхансерами», которые повышают уровень транскрипции. Некоторые гены содержат также «сайленссры» — участки, ослабляющие транскрипцию.
Гены млекопитающих— это сложные, многокомпонентные структуры. Транскрипция геков Основное направление передачи генетической информации реализуется в цепочке ДНК вЂ” мРНК -+ белок (рис. 36.1, см. также гл. 4!). Процесс этот жестко контролируется и состоит из ряда сложных этапов, каждый из которых регулируется одним или несколькими ферментами или факторами.
Ошибка на любом этапе может приводить к заболеванию. ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ В основе методологии генной инженерии лежит выделение ДНК и проведение различных манипуляций с ее молекулами, включая получение химер (например, молекулы ДНК, построенной нз фрагментов ДНК человека и бактерий). Ферменты рестрикции Один из важнейших инструментов генной инженерии — эидоиуклеазы, ферменты, расшепляюшие ДНК по специфическим последовательностям нуклеотидов внутри цепи (в противоположность экзоиуклеязам, которые расщепляют ДНК с концов молекулы).
Эти ферменты получили название рестриктаз, поскольку их присутствие в бактериальной клетке ограничивает рост определенных бактериальных вирусов, называемых бактериофагами. Рестриктазы расщепляют ДНК на относительно небольшие фрагменты в участках последовательности строго определенной структуры. Этим их воздействие отличается от большинства других ферментативиых, химиче- Технология рекомбинантных ДНК 37 Участок и ни цизцил транскрипции Ф Экзон Сзйт полиадени- лироввния Промоторнзя область Экзон СААТ ТАТА 5* Интрон Некодирующзя область Регуляторная область ААТААА ДНК 5' 3' Некодирующея область Первичный РНК-тренскрипт Модификация 5'- и 3'-концов ААА--А Ро1у (А) хвост Удаление интронов и сщивение экзонов ААА — -А Модифицированный трзнскрипт КЭП Процессировзннзя ядерная мРН К | Трзнсмембранный — —— транспорт ААА--А Цитоплезма мРНК Трансляция ЙН, СООН Белок Рис.
ЗбЛ. Организация транскрипционной единицы и этапы экспрессии эукариотическнх генов. Эукариотические гены состоят нз структурной и регуляторной областей. Структурная область представлена кодирующей ДНК и некоднрующимн 5'- и 3'-последовательностями. Кодирующая ДНК включает экзоны — участки ДНК, транскрипты которых остаются в составе зрелой мРНК, и интроны (транскрнпты этих последовательностей удаляются из РНК в ходе процессинга). Структурная область гена ограничена с 5'-конца сайтом инициации транскрипции, а с 3'-конца — полнаденилатным сайтом нли сайтом терминацин.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
