Biokhimia_cheloveka_Marri_tom_2 (1123307), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Промоторная область, содержащая специфические последовательности, взаимодействующие с белковыми факторами„рассмотрена в гл. 39 и 41. Первичный транскрипт имеет на 5'-конце специфическую структуру — КЭП и участок, богатый «А» на 3'-конце. После удаления интронов нз первичного транскрипта образовавшаяся зрелая мРНК транспортируется в цитоплазму, где и транслируется с образованием белковой молекулы. ских илн физических воздействий, приводящих к случайным разрывам цепей ДНК. Рестрик тазы (уже открыто более 200 типов ферментов этого класса) являются частью защитной системы бактерий, охраняющей собственный геном от чужеродной, главным образом вирусной, ДНК. Рестриктазы присутствуют только в таких клетках, которые содержат и специфические метилазы, Роль этих ферментов — метилирование собственной (хозяйской) ДНК клетки и зашита ее таким образом от действия рестриктаз.
Сайт-специфические метилазы и рестриктазы всегда присутствуют в бактериях одновременно. Рестриктазы принято именовать по названию бактерий, из которых их выделяют (табл. Зб.1). Так, название ЕсоК1 свидетельствует о том, что этот фермент выделен из ЕзсйепсЫа соК ВатН1 — из ВасИиз атйо!щие~асизи. Первая из трех букв аббревиатуры соответствует первой букве названия рода (Е). Последующие две буквы являются начальными буквами видового названия (со). Буква 1с говорит о том, из какого штамма выделен фермент. Римская цифра соответствует порядковому номеру рестрикт азы в ряду аналогичных ферментов, выделенных из этого микроорганизма (например, Есор, ЕсоИ1).
Каждый фермент узнает определенную 4 — 7-членную последовательность в двухцепочечной ДНК. Разрезание ДНК по этим сайтам приводит к образованию либо «тупых» (например, при действии рестриктазы Ора1), либо «липких», т.е. перекрывающихся (например, ВатН1), концов (рис. 36.2). Для конструирования гибридных молекул особенно удобны липкие концы (см. ниже). Если допустить, что нуклеотиды распределены по молекуле ДНК совершенно случай- Глава Зб Таблица 36Л.
Некоторые рестриктазы и расщепляемые ими последовательно- сти А — аденин; С вЂ” цитозин; Π— гуаннн; 1 ~имин. Стрелки указывают на сваты расгпепления. В результате рестрикции могут формгЧюваться «липкие» (Вае Н1) или «тупые» (Нра 1) концы. Длина узнаваемой последовательности варьирует н составляет 4 ц.н. для Та) 1, 5 п.н. для Есо ВП, б п.н. для Есо Н) н 7 и.н. для Мж и.
Согласно принятым правилам, верхняя цепь последовательности-мишени представлена в ориентации 5'- 3', а нижняя — в ориентации Э'- 5'. Обратите внимание, что большинство последовательностей яялается палиндромами (т.е. читаются одинаково в противоположных направлениах по разным цепям). Остаток, обозначенный Х, означает любой нуклеотид.
ным образом, можно рассчитать частоту встречаемости участка узнавания для данной рестриктазы. В каждой нуклеотндной позиции молекулы ДНК с одинаковой вероятностью может оказаться один из 4-х нуклеотидов (А, хх, С, Т). Поэтому фермент, узнающий четырехзвенную последовательность, будет находить одну мишень на 25б пар оснований (44). В то же время фермент, различающий шестизвенную последовательность, будет находить специфический участок узнавания 1 раз на 4096 пар осно- 39 Технология рекомбинантных ДИК А "Липкие" концы С ТА66 6 6АТСС ССТА6 6 ~ "Тупые"концы 6ТТ ААС САА т т6 аттддс сААтта Ряс..
асшепление . Зб.2. Р ДНК рестрицирующими зндонуклеазами (рестриктазами). В результате рестрикции образуются фрагменты (рестрикты) либо с «липкими» (А), либо с «туп (Б) < ыми» концами. Другие ферменты Ряд других ферментов, использукицих ДНК в качестве субстрата, также имеет важное значение для генной инженерии. На некоторых из них мы остановимся в этой и последующих главах (табл. 36.2).
Конструирование химерных молекул ДНК Ковалентное соединение (в дальнейшем мы будем пользораться термином «лигирование») липких концов фрагментов ДНК вЂ” процедура технически не Таблица 36.2. Ферменты, используемые в работе с рекомбинантными ДНК. (Адар сед апд ге одцсед, яа(с(т рептпяяюп, Ггош рг Ешегу А. Е. Н. Раде 41 1п: Ап ннгодпсйоп 1о КесотЬ(палс 01ЧА, %йеу, 1984.) Область приложения Реакция Ферьсеит Удаление 5-РО4 групп перед введением метки методом кинирования, а такясе для предотвращения лигирования молекул вектора по типу «сам на себя» Введение концевых делеций в молекуды ДНК «Сшивание» молекул ДНК Дефосфорилирует 5'-концы РНК и ДНК Щелочная фосфатаза ВА1=31 нуклеаза ДНК-лигаза ДНК-полнмераза 1 ДНКаза1 Экзонуклеаза И1 Удаляет нуклеотиды с 5'-концов ДНК Переносит терминальный (в Т-полохсении) фосфат АТР на 5'-ОН-группы ДНК и РНК Синтезирует ДНК по РНК-матрице Х-Экзонуклеаза Полинуклеотидкиназа Синтез кДНК по мРНК; картирование РНК (с 5'-конца) Удаление шпильки при синтезе кДНК: РНК- картирование (как с 5'-„так и с 3'-конца) Создание гомополимерных «хвостов» Обратная транскриптаза Нуклеаза Я Деградирует одноцепочечную ДНК ваний (4').
Любой фрагмент ДНК обладает характерным расположением сайтов узнавания различных рестриктаз, что позволяет строить так называемые рестриктазные карты. При расщеплении ДНК какой- либо одной рестриктазой получают смесь фрагментов, каждый из которых имеет одни и те же концевые участки. Такие фрагменты можно разделить методом злектрофореза в агарозном илн полиакриламидном геле (о методах блоттинга см.
ниже). Эта процедура, основанная на применении рестриктаз, представляет собой важнейший зтап клонирования генов. Деградация как 5'-, так и 3'-концов ДНК Катализирует образование связей между молекулами ДНК Синтез двухцепочечной ДНК по ДНК-матрице В соответствующих условиях вносит одноцепочечные разрывы в ДНК Удаляет нуклеотиды с 3'-концов ДНК Терминальная транс- Добавляет нуклеотиды к 3'-концу Д НК фераза Синтез двухцепочечной кДНК; ннк-трансляцня Ник-трансляция, картирование гиперчувствительных участков в ДНК Секвенирование ДНК, картирование ДНК- белковых взаимодействий Секвенирование ДНК Введение «ЯР в ДНК и РНК Глава Зб сложная. однако прн этом могут возникать определенные проблемы.
Так, липкие концы вектора могут лигироваться сами на себя без включения клоннруемого фрагмента. Кроме то~ о, может произойти отжиг липких концов двух различных фрагментов, что приведет к образованию гетерогенной вставки. Не все интересующие исследователя участки ДНК содержат удобно расположенные сайты узнавания для рестриктаз, даюших липкие концы. Для преодоления этих трудностей иногда используют рестрнктазы, образуюшие тупые концы, после чего с помощью специфического фермента (терминальной трансферазы) генерируют новые концы.
Так, присоединение к 3'-концам вектора гомополимерной цепочки, состоящей из дО, а к 3'-концам клонируемого фрагмента ДНК вЂ” цепочки ро!уд(С) — обеспечивает исключительно межмолекулярный отжиг. В ходе этой процедуры, получившей название «присоединение гомо- полимерного хвоста», образуется также сайт для рестрнктазы Ята1, что обеспечивает возможность последующего вырезания клонированного фрагмента.
Иногда к тупоконечной ДНК присоединяют синтетические олигонуклеотидные лннкеры, содержащие участки узнавания для определенной рестриктазы. С использованием ДНК-лигазы бактериофага Т4 может проводиться и непосредственное лнгированне фрагментов с тупыми концами. Этот метод, менее эффективный, чем литирование по липким концам, имеет однако то преимущество, что с его помощью возможно сшивание любых пар фрагментов.
К недостаткам его следует отнести невозможность легко проконтролировать ориентацию вставки и число встроенных фрагментов, а также «вырезать» клонированный фрагмент из рекомбинантной молекулы ДНК. Клонирование Понятие «клон» определяегся как большая популяция идентичных молекул, бактерий илн клеток— потомков одного предка. Клонирование позволяет получать большое количество идентичных молекул ДНК, которые можно охарактеризовать и использовать в каких-то целях. Метод клонирования основан на том факте, что химерные или гибридные молекулы ДНК могут быть сконструированы в составе векторов для клонирования, к которым относятся бактериальные плазмиды, фагн или космиды, способные к репликацни в хозяйских клетках под контролем своих собственных регуляторных элементов. Таким путем добиваются амплификации химерной ДНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
