Biokhimia_cheloveka_Marri_tom_2 (1123307), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Общая схема процесса клонирования представлена на рис. Зб.3. Бактериальные илазмиды — это небольшие кольцевые молекулы двухцепочечной ДНК, в функции которых входит, например, обеспечение устойчивости к антибиотикам для несущих их хозяйских кле- ток. Плазмиды обладают несколькими свойствами, которые делают нх чрезвычайно удобными для использования в качестве векторов для клонирования: 1) в бактериальной клетке они могут существовать в одной или множестве копий; 2) реплицнруются плазмиды независимо от хозяйской ДНК. В настоящее время для многих плазмид уже известна полная нуклеотидная последовательность.
Это делает возможным точную локализацию сайтов рестрикции для клонирования фрагментов ДНК. Плазмиды значительно меньше хозяйской хромосомной ДНК и поэтому могут быть легко отделены от нее. Клонированный фрагмент легко выделяется из рекомбинантной плазмнды посредством ее расщепления той же рестриктазой, по сайту которой проводили лигированне. Фаги обычно содержат линейную ДНК, в которую могут быть встроены фрагменты чужеродной ДНК по какому-либо нз доступных сайтов рестрикции. Химерную ДНК выделяют обычно после завершения рекомбинантным фагом литического цикла и выхода зрелых инфекционных фаговых частиц.
Основным преимуществом фаговых векторов перед плазмидными является то, что в отличие от плазмид, способных нести фрагменты ДНК до б — 10 т. и.н., в фаговые частицы удается встраивать фрагменты размером до 10 — 20 т. и. н. Величина клонируемого фрагмента определяется общим количеством ДНК, способным упаковываться в головку фага, Фрагменты еще большего размера могут быть клонированы в космидах — векторах, объединяющих преимущества плазмид и фагов.
Космиды — это плазмиды, содержащие специфические участки, называемые соя-сайтами, которые необходимы для упаковки ДНК фага Х в капсид. Эти вектора могут поддерживаться в бактериальной клетке в плазмидной форме, но так как большая часть ДНК фага из космиды удалена, то соответственно увеличивается и возможная длина клонируемого фрагмента. Довольно обычными для космид являются вставки размером 30 — 50 т. п.н. Свойства векторов трех типов сравниваются в табл.
36.3. Когда решается вопрос о том, в какую область вектора ввести клонируемый фрагмент, необходимо учитывать, что вставка в функционально важную последовательность неизбежно нарушит какое-либо из свойств вектора. Впрочем, такое нарушение может быть использовано в целях селекции рекомбинантных молекул. Например, широко распространенный плазмидный вектор рВЮ22 несет гены устойчивости к двум антибиотикам — амшщяллину и тетрациклину.
Для клонирования часто используется уникальный Рай-сайт в гене устойчивости к ампициллину. Встраивание чужеродного фрагмента ДНК приводит к ннактнвации гена ампнпнллинустойчнвостн, и бактерии, несущие такую рекомбинантную плаз- Те.тнозоги ч рекомбииотвтшы.т ДОК Кольцевел ллазмнанал ДНК с. ДНК-лнтаза Т Молекула ллезмнаноа ДНК со встроенным фрагментом ДН К человека 1рекомбннантнал молекула ДНК) Рис. Зб.З.
Использование рестриктаз для конструирования рекомбинантных или химерных молекул ДНК. Введенная обратно в бактериальнунз клетку (при трансформации) плазмида реплицируется, а вместе с ней реплицируется и последовательность-вставка. Поскольку воссоединение липких концов реконструирует сайт узнавания рестриктазы, кланированный фрагмент может быть легко выделен из рекомбинантной плазмиды при помощи той же рестриктазы.
Если при этом использовать смесь всех фрагментов„образованных в результате расщепления тотальной ДНК человека одной и той же эндонуклеазой, то при помощи клонирутощих плазмид можно получить около миллиона различных рекомбинантных молекул ДНК„каждая из которых дает начало индивидуальному бактериальному клону. (Моййес) апд гергодисес), упг)з репп)аа)оп, )гопз Со)зеп Б)ч: Т)те гпащрп1айоп оГ йепеа. Бей Апт. 13и1у) 1975; 233: 34.) Таблица Зб.З.
Широко распространенные векторы для кло- нирования Геиомиые библиотеки и их конструирование Вектор Размер клоиирусмого фрагмента ДНК (аставки) 0,01 — 1О т. п. н. ! 0 —. 20 т. п. н. 35 — 50 т. п.н. Плазмида рВтс322 Лямбда Харон 4А Космиды миду, становятся чувствительными к этому антибиотику (рис. 36.4).
Это позволяет легко отличить исходную плазмиду, обеспечивающую устойчивость бактерии-хозяина к обоим антибиотикам, от рекомбинантной формы. Чтобы получить еще более четкие доказательства того, что плазмидная ДНК действительно является химерной (несет вставку), можно сравнить размеры сконструированной плазмиды с исходной методом гель-электрофореза. Рекомбинантная плазмида, естественно, будет иметь больший молекулярный вес. Подобрав соответствующие условия клонирования, можно добиться того„что в наборе клонированных фрагментов будут содержаться практически все гены данного генома. Такие коллекции клонов, полученные для конкретного генома, называют геиомиыми библиотеками. Геномная библиотека готовится из тотальной ДНК клеточной линии нли ткани.
В отличие от геномной библиотеки библиотека кДНК представляет популяцию мРНК в ткани. Геномная библиотека готовится методом частичного расщепления тотальной ДНК какой-либо «мелкощепящей» рестриктазой (например, ЯаиН1А). Смысл такой обработки заключается в том, чтобы получить популяцию больших фрагментов ДНК, содержащих полноразмерные гены. Для конструирования геномных библиотек предпочтительно использовать фаговые векторы, так как они позволяют клонировать очень протяженные фрагменты ДНК (до 20 т.и.н.). Число независимо полученных фаговых клонов, тре- Глава Зб Гзи устройчивссти Гзи устойчивости стройчивости тзтрзци клику Раск рывзкиз кольца рзстриктвзой Ю! %ЕЕЕЬ Встраивания Рзт1- фрзгмзизз кяоиирузмой ДНК я!сходняк тезмиаз рвн322 Химзризи пяззмидз рВНЗ22 Рис. Зб.4. Метод выявления рекомбннантных молекул ДНК. Фрагмент ДНК встроен в уникальный Ря! 1-сайт плазмиды рВВЗ22.
«Вставка» инактнвирует ген, кодирующий белок, который обеспечивает устойчивость бактерии-хозяина к ампициллину. Следовательно, бактериальные клетки, несущие рекомбннантную ДНК, не способны формировать колонии на среде, содержащей этот антибиотик. Используя для анализа трансформаитов среды с тетрациклином и ампициллииом, можно отобрать клоны, несуцвяе рекомбннантные плазмиды. Источник Представительная геномная библиотека Е. сой Дрожжи Дрозофила Млекопитающие 1500 фрагментов 4500 фрагментов 50000 фрагментов 800000 фрагментов ч Число фрагментов (независимых клонов), необходимое для создания библиотеки„гарантированно прелставляюшей все уникальные гены, обратно пропорционально среднему размеру клоннруемых фрагментов н прямо пропорционально общему количеству генов данного организма.
Числа,приведенные выше, даны для библиотек с 99%-ной вероятностью представляющих полный геном прн размере клонируемых фрагментов 2.10« пар нуклеотидов. Различая в необходимом числе индивидуальных клонов отражают различную степень сложности геномов соответствующих организмов. Число необходимых клонов рассчитывается по формуле !п(1 — Р) 1Ч = 1п(1 — 1) где Р— желаемая вероятность, а à — доля тотального генома в ин- дивидуальном клоне.
Для млекопвтающнх, характеризующихся сложностью гаплоилного генома 3 10з, зто уравнение будет выгля- деть следующим образом: !и (1 — 0,99) !и 1 Преимушеспю библиотек, сконструированных на основе «вставок» большого размера, становится очевилиым, если произвести соответствующие вычисления для гипотетической вставки со средним размером 5-10з вместо 2 10'. буемых для создания представительной библиотеки, обратно пропорционально размеру клонируемых фрагментов, но прямо пропорционально размеру генома (табл.
36.4). Библиотека генома человека, состоящая из 1О' клонов со встроенными достаточно протяженными фрагментами, с вероятностью около 99% содержит любой уникальный ген. Получение такой библиотеки обеспечивает высокую вероятность выявления интересующего гена. Библиотека кДНК готовится в несколько этапов. Сначала выделяют тотальную мРНК ткани, а затем с помощью обратной транскриптазы и ДНК- пол имеразы проводят обратную транскрипцию мРНК в двухцепочечную ДНК. По техническим причинам редко удается получить полноразмерную копию мРНК (кДНК). Как правило, клонируются более короткие ее фрагменты.
Для этой работы обычно используют плазмиды, так как работать с ними легче, чем с фаговыми и космидными векторами. Впрочем, существует целый класс векторов — лямбдоидные фаги,— специально предназначенных для клонирования кДНК (см. ниже). Векторы, обеспечивающие синтез белка, кодируемого клонированным геном, называют экспрессирующими. Такие векторы широко используют для выявления специфических кДНК молекул в кДНК- библиотеке, а также для наработки генно- инженерных белков.
Специально сконструированные экспрессирующие векторы имеют, как правило, сильный индуцибельный промотор, кодоны инициа- Таблица 36.4. Состав представительных геномных библиотек" Технология рекомбинактных ДИК ции трансляции для всех возможных рамок считывания, терминаторы транскрипции и трансляции и, если необходимо, определенные сигналы процессинга белка.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
