Biokhimia_cheloveka_Marri_tom_2 (1123307), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Некоторые экспрессирующие векторы содержат гены ингибнторов протеаз, что увеличивает выход продукта экспрессируемого гена. Для конструирования библиотек кДНК весьма часто используется вектор Хй1 11. Этот вектор позволяет клонировать достаточно длинные фрагменты кДНК и вместе с тем обеспечивает транскрипцию и трансляцию клонированных генов. Для скрининга кДНК- библиотек, полученных на основе вектора Хб1 11, пригодны как кДНК-зонды, так и специфические антитела.
Зонды Для выявления специфического клона в составе геномных или кДНК-библиотек, а также прн количественном определении ДНК илн РНК используются различные типы молекулярных зондов. Как правило, зонды (пробы) — это фрагменты ДНК или РНК, содержащие меченые " Р-нуклеотиды.
Работа с зондами основана на способности последних «узнавать» комплементарные последовательности в молекулах ДНК или РНК. кДНК, синтезированная на матрице специфической мРНК, может быть использована в качестве зонда при скринировании библиотеки кДНК и геномной библиотеки. Один из наиболее распространенных методов поиска специфических последовательностей основан на применении синтетических олигонуклеотидов, последовательность нуклеотидов в которых подбирается по аминокислотной последовательности небольшого участка искомого белка с учетом вырожденности кода.
При условии точного совпадения последовательности, длины олнгонуклеотидного зонда в 15 — 20 звеньев оказывается достаточно для достоверной гибридизации и обнаружения уникального гена. кДНК-зонды используются также для выявления после электрофореза специфических фрагментов ДНК или РНК и переноса их на нитроцеллюлозный фильтр (методы «Саузерн-блоттинга» и «Нозерн-блоттинга» соответственно). Блоттииг и техника гибридизации Для визуализации специфического фрагмента ДНК или РНК среди тысяч других «примесных» молекул используется комбинация целого ряда экспериментальных приемов, которые в совокупности получили название «блоттипг».
На рис. 36.5 показаны схемы проведения Саузери-блоттинга (для визуализации фрагментов ДНК), Нозерн-блоттиига (для РНК) и Вестерн-блоттинга (для белков). Первая процедура названа по имени автора методики, остальные возникли как лабораторный жаргон, но со вре- менем стали общепринятыми терминами. Первая методика полезна при определении количества копий гена (копнйности) в данной ткани или при выявлении значительных структурных изменений в генах (делеции, вставки или перегруппировки).
Иногда даже удается выявить точковую мутацию, если она затрагивает сайт рестрикции. Нозерн- и Вестерн- разновидности блоттинга используются для определения молекулярных размеров и количества специфических РНК и белковых молекул. Для идентификации н выделения интересующих исследователя клонов разработан метод гибридизации в бактериальных колониях или фаговых бляшках. На колонии бактерий, выращенные на твердой среде, сначала накладывают нитроцеллюлозный фильтр.
Бактерии прилипают к фильтру. После лизиса и денатурацин под действием ХаОН и фиксирования денатурированной ДНК прогреванием фильтр инкубируют в растворе с радиоактивно меченным зондом. По окончании гибридизации фильтр отмывают от избытка зонда и выявляют образовавшийся меченый гибридный комплекс путем контакта с рентгеновской пленкой. Сравнивая положение пятна на радиоавтографе с положением колоний на чашке, выбирают ту из них„которая дала положительный сигнал. Аналогичным образом поступают и прн идентификации клонов на основе фаговых векторов. Результатом этих манипуляций является выделение искомых индивидуальных клонов (бактериальные колонии или фаговые бляшки).
Все разновидности методов гибридизации, рассмотренные в этой главе, базируются на вышеупомянутых специфических взаимодействиях пар оснований комплементарных цепей нуклеиновых кислот. Точное соответствие последовательностей гибридизующихся фрагментов приводит к быстрому образованию прочного комплекса, устойчивого к высокой температуре в ходе гибридизации и отмывки.
Такие комплексы устойчивы также и при низкой концентрации соли. Комплексы, образующиеся при относительно более слабом соответствии структуры цепей, в «жестких» условиях (высокая температура или низкая концентрация соли) менее устойчивы. При этом гибридизация либо не происходит вовсе, либо гибридный комплекс разрушается при отмывке.
Генные семейства, у которых наблюдается некоторая степень гомологин, можно выявить варьированием условий гибридизации и отмывки. Этот же подход применяется и прн сравнении аналогичных генов разного видового происхождения. Определение последовательности ДНК (ееквепироввиие) В настоящее время разработаны методы определения полной нуклеотидной последовательности ДНК (рис. 36.6).
При решении этой задачи необходи- Глада Зб Вестарн-блот Нозерн-блот Сау терн-блот ктрофорез 1 Перенос не фильтр кДНК-зонд кДНК-зонд Антителе Инкубаиия с зондом Редиоеетограф Рис. 36.5. Блоттинг-перенос. По методу Саузерна тотальную ДНК, выделенную из культуры клеток или ткани, обрабатывают одной или несколькими рестриктазами и полученную смесь фрагментов подвергают электрофорезу в агарозном или цолиакриламидном геле.
ДНК, несущая отрицательный заряд, мигрирует к аноду. Небольшие фрагменты двигаются быстрее крупных. После окончания электрофореза разделенные фрагменты ДНК подвергают мягкой денатурации, инкубируя гель в растворе щелочи. На следующем этапе гель накладывают на нитроцеллюлозный фильтр. Фрагменты ДНК переносят на нитроцеллюлозу с помощью методических приемов, разработанных Саузерном, и фиксируют полученную нитроцеллюлозную реплику тепловой обработкой. Далее реплику инкубируют с меченым кДНК-зондом, гнбридизующимся с соответствующим комплементарным фрагментом ДНК на нитроцеллюлозиом фильтре.
После интенсивной промывки фильтр помещают на рентгеновскую пленку. Фиксируемые на радиоавтографе сигналы соответствуют расположению фрагментов ДНК, комплементарных последовательности зонда. Метод Нозерн-блот (для анализа РНК) принципиально не отличается от метода переноса по Саузерну (Саузерн-блог анализа). Тотальную РНК подвергают электрофорезу. Сама процедура переноса РНК из геля на фильтр несколько отличается от метода Саузерна, поскольку молекулы РНК менее стабильны. чем молекулы ДНК.
Метод Вестерн-блот применяется для выявления определенных белков с помощью специфических антител или других молекулярных зондов. НЕКОТОРЫЕ ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ ТЕХНОЛОГИИ РЕКОМБИНАНТНОИ ДНК мо иметь большое количество идентичных молекул ДНК. Наработку интересующей последовательности можно осуществить клонированием соответствующего фрагмента. Проиллюстрированный на рнс.
Зб.б метод секвенирования по МаксимуГнлберту основан на химическом расщеплении ДНК по определенному основанию. Другой ферментативный метод — метод Сзнгера — базируется на применении аналогов нуклеотидов, прерывающих синтез комплементарной цепи ДНК по одноцепочечной матрице в месте встраивания в цепь соответствующего аналога. Выделение специфического гена из целого генома требует методики, с помощью которой можно среди миллиона сходных элементов найти один, нужный исследователю. Идентификация регуляторной последовательности длиной в 10 нуклеотидов требует чувствительности, соответствующей выявлению 1 элемента из 3 х 10'.
Серповндноклеточная анемия вызвана заменой только 1 основания в геноме, т,е. Технология рекомбишмтных ДИК 45 3' б' Этан 2. Ввеление радиоактивной метки в 5'- или 3'-концы каждой цепи. 3' Ф Ф 3' Этан 3. Плавление ДНК и выделение популяций одноцепочечных ДНК. 3' Этап 5. Разделение компонентов смеси по размеру с помощью электрофореза а пластине полиакриламидно- го геля. Короткие фрагменты мигрируют быстрее длинных. По завершении электрофореза гель помещают на рентгеновскую пленку, на которой проявляются полосы. соответсгвующие распрелелению по длинам мече- ных фрагментов в каждой реакционной смеси.
6 6+А Т+ С С Деградггроеонные осноеакиге А 6 Т С Т Т 6 6 А 6 С Т 6 6+А Т+С С Отрезки в правой части рисунка предсппшяют длину фрагментов расщепленной исходнои последовательности ДНК. Зная, какое из оснований разрушается данным реагентом, можно опрелелить последовательность расположении нуклеотядов в направлении от меченого коппи к иемеченому, считывая радиоавтограф снизу вверх. Правила комплементарных взаимодействий нуклеиновых оснований по Уотсону и Крику (А — Т; Π— С) позволяют восстановить также и последовательность комплементарной цепи.
Рис. Зб.б. Определение нуклеотидной последовательности ДНК (секвенирование ДНК) по Мак- саму — - Гилберту. Этап 1. Выделение популяции (- Ю") идентичных молекул ДНК. (Идентичные молекулы, естественно, обладают идентичными концевыми участками, нуклеотидной последовательностью и длиной.) Очевидно, что молекулярное клонирование и рестрикция являются наиболее зффсктивными методами получения такой популяции молекул.
Этап 4. Полученную ДНК распределяют по 4 пробиркам. В каждую пробирку добавляют химический реагент„специфически разрушающий 1 или 2 определенных нуклеиновых основания. В результате ДНК-цепь разрывается в месте нахождения данного нуклеотцпа. Это расщепление должно контролироваться так, чтобы оно было неполным и чтобы только часть цепей разрывалась по всем участкам„в которых накопится разрушаемое основание. Роси1енление Рйоиролеиее Раосуи.яеиие /Ьси4еооеиие оа С оедиС но 7иС оо С Эта процедура генерирует смесь ралиоактивно меченных (и множества немеченых) фрагментов одноцепочечиой ДНК различной длины.
Длина меченых фрагментов соответствует числу нуклеотидов между меченым концом цепи ( а ) и положением в ней нуклеинового основания, подвергшегося химической атаке. Искоумсяяг ггослерователаггооть З1Š— А- 6 — Т вЂ” С вЂ” Т вЂ” Т- 6 — 6 — А — 6 — С вЂ” Т вЂ” 3' 46 Глава 36 Генетическое картирование Получение белкоа Ген Заболевание Хромосома Инсулин Пролактин Гормон роста а-Глобин 13-Глобин Адсноз ни-дсзаминаза Фен илаланин-гидроксилаза Гипоксантин-гуанин-фосфо- рибозилтрансфсраза Сегмент ДНК ОЗ 11р15 бр23-с1!2 17с121-цгсг !бр!2-ргег 11р12 20с113-с!1ег 12ц24 Хц26-ц27 Недостаточность гормона роста ц-Талассемия 13-Талассемия, серповидные клетки Недостаточность аденознн-дсзаминазы Фенилкетонурия Синдром Леша — -Найхана Хорея Гентингтона 4р В таблццс представлены хрпмосомные локализации нескольких гсипв и болезни, вызванные нарушениями в продуктах этих генов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
