Biokhimia_cheloveka_Marri_tom_2 (1123307), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Обычно точковые мутации идентифицируют путем определения нуклеотидной последовательности изучаемого гена, но, если мутация затрагивает сайт рестрикции, для ее выявления достаточно рестрикциониого анализа. Делеции и вставки ДНК-фрагментов больших чем 50 пар оснований определяют методом блоттинга по Саузерну. Технояогнч рекомбшшитны т ДИК А Мзт 11 еейты в первой половине гена 13 глебике Нормальный (А1 б' Серповидно- клеточный (8) Анализ родословных езмер Фрагментов 1,Зб т.
. н. 1,15 т. и н. АБ АБ ББ АА АБ АБ Фенотип Рис. Зб.й. Анализ родословных в случае серповндноклеточной анемии. В верхней части рисунка (А) показано начало гена В-глобина с сайтамн расщепления рестрнктазой Мз1 И (1) у нормального (А) и серповидноклеточного (Б) В-глобина. В результате расщепления ДНК здоровых индивидуумов рестриктазой Маг И образуются специфические фрагменты ДНК размером 1,15 н 0.2 т.п.н. Замена одного основания у больных серповидноклеточной анемией приводит к потере одного нз трех Ма И-сайтов в области гена и соответственно к появлению только одного специфического Мзг И-фрагмента размером 1,35 т.
п. н. Это различие в длине легко обнаруживается методом Саузерн-блоттннга Щ. (На данном рисунке положение фрагмента ллиной 0,2 т. п. и. не указано.) Анализ родословных демонстрирует три возможных генотипа. АА-норма (О), АБ-гетерозигота по гену серповидноклеточности (9(я) и ББ-гомозигота по гену серповидных эритроцитов (И). Этот подход позволяет осуществлять пренатальную диагностику заболевания серповидноклеточной анемией и выявлять гетерозиготных носителей соответствующего гена (фе). сайтов рестрикции (как в только что рассмотрен- ном примере).
Пренатальная диагностика неизменными и могут быть расщеплены этой рестриктазой. Поэтому Саузерн-блоттинг обработанных ферментом образцов ДНК нормальных (АА), гетерозиготных (АБ) и гомозиготных (ББ) пациентов дает три типа распределения фрагментов (рис. Зб.9).
Этот пример показывает, как на уровне ДНК можно провести анализ родословной с использованием описываемых в этой главе принципов и подходов. Такой анализ весьма эффективен при изучении ряда генетических заболеваний, вызванных делениями, вставками и (реже) точковыми мутациями с изменением Дородовая диагностика наследственных заболеваний возможна, если известна природа генетического нарушения и имеется соответствующий зонд. Анализу по Саузерну можно подвергнуть ДНК клеток, собранных из 1О мл амниотической жидкости (или полученных с помощью биопсии ворсинок хо- Глава 36 50 риона). Плод с рестрикционным вариантом АА (рнс. 36.9) нормален и не является носителем серповидно- клеточной анемии.
В случае варианта БЯ можно с уверенностью предсказать развитие болезни. Уже сейчас существуют зонды для подобного анализа многих заболеваний. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) Генная терапия Заболевания, вызванные функциональной недостаточностью продукта того или иного гена, можно лечить с помощью «заместительной» терапии (табл. 36.5). Стратегия подхода заключается в клонировании гена (например, гена, кодирующего аденозиндезаминазу) в векторе, способном включиться в геном клетки хозяина. Весьма перспективным представляется использование для этого предшественников клеток костного мозга.
Можно надеяться, что такие клетки «приживутся» и будут размножаться, синтезируя трансгенный продукт. Конечно, ген, перенесенный в соматические клетки, потомкам не передается. В последнее время ведутся интенсивные поиски Ген Х Интаитная ДНК 5' Фрагменты Первичный зонд Рнс. 36ЛО. Метод «прогулка по хромосоме». Пусть необходимо обнаружить ген Х в рамках протяженного фрагмента ДНК. Точное положение гена неизвестно, однако имеется первичный зонд (»), соответствующий некоему участку генома (показан в данном случае на 5'-конце исследуемого фрагмента ДНК). Кроме того, имеется библиотека перекрывающихся фрагментов генома.
(Для упрощения на рисунке изображены только пять фрагментов.] Первичный зонд гнбрнднзуется только с клонами. содержащими фрагмент 1. Этот фрагмент можно использовать далее в качестве зонда для выявления фрагмента 2. Процедура последовательной гибридизации повторяется вплоть до обнаружения фрагмента 4, который гнбрнднзуется с фрагментом 5, содержащим искомый ген Х.
Изменения в последовательностях ДНК, вызванные описанными выше причинами, могут обусловливать изменения в расположении сайтов рестрикции и поэтому сказываться на длине рестрикционных фрагментов. Устойчивое наследуемое изменение в распределении длин рестрикционных фрагментов (наблюдаемое для более чем 1% численности популяции) называют иолиморфизмом длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Этот феномен может быть результатом либо точковых замен (серповидноклеточная анемия)„либо делеций и вставок (талассемии). В последнее время ПДРФ стали с успехом использовать в диагностических целях.
Рестрикционный полиморфизм обнаружен как в последовательностях известных генов, так и в участках ДНК с неизвестной функцией. ПДРФ может нарушать биологическую функцию, а может и не иметь никаких биологических последствий; в любом случае соответствующие измененные локусы наследуются в соответствии с законами Менделя. Основная область использования этого феномена (а известно уже около 350 случаев ПДРФ) — диагностика наследственных заболеваний, функциональная природа которых неизвестна.
Вначале с помощью ПДРФ устанавливают группу сцепления, а затем методом последовательной гибридизации определяют локус, ответственный за заболевание. Согласно методу последовательной гибридизации, фрагмент, представ- ляющий один из концов длинной цепи ДНК, используют в качестве зонда для выявления другого фрагмента, который перекрывается с первым и в то же время выходит за его пределы. Применение этого подхода, называемого «прогулка по хромосоме» (рис. 36.10), обеспечивает «передвижение» по цепи ДНК вплоть до интересующей области.
Направление передвижения контролируется по рестрикционной карте. «Прогулка по хромосоме» особенно удобна при изучении Х-сцепленных болезней, поскольку в данном случае экспрессируется только один из двух аллелей. 20% выявленных случаев ПДРФ относится именно к Х-хромосоме, и именно для нее составлена практически полная карта. Используя феномен ПДРФ, можно локализовать ген любой Х- сцепленной болезни (например, мышечной дистрофии Дюшенна). С помощью ПДРФ удалось установить, что генетический дефект при хорее Гентингтона затрагивает конец короткого плеча хромосомы 4, а ген„вызывающий поликистоз почек, сцеплен с локусом а-глобина на хромосоме 16. Технология рекомбинантных ДНК путей генно-инженерного воздействии на половые клетки.
Соответствующие эксперименты проводит на лабораторных животных. Гены, инъецированные в оплодотворенные яйцеклетки мыши, в некоторых случаях встраиваются в геном. Полученных трансгеиных животных используют для изучения характера экспрессии генов в разных тканях, а также для выявления специфических генов онтогенеза. Транс- генный подход недавно с успехом был использован для коррекции генетического дефекта у мышей. В оплодотворенные яйцеклетки мыши с наследственным гипогонадизмом (гл. 55) инъецировали ДНК, содержащую кодирую щую последовательность предшественника гонадолиберина. У части развившихся из таких яйцеклеток мышей этот ген нормально экспрессировался.
Фенотипически эти мыши были нормальными во всех отношениях. Их потомство также не проявляло недостаточности по гонадолиберину. Приведенный пример свидетельствует о принципиальной возможности экспрессии трансгенов в соматических клетках и их передачи потомству. СЛОВАРЬ-СПРАВОЧНИК Бактериофаг. Вирус, инфицирующий бактерии.
Библиотека. Коллекция клонированных фрагментов, представляющих какой-либо геном. Различают геномные библиотеки (включают последовательности и интронов, и экзонов) и кДНК-библиотеки (только экзоны). Вектор. Плазмида или бактериофаг, в которые может быть введена чужеродная ДНК с целью клонирования.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
